Die Rolle von neutrophilem und thrombozytärem ADAM10 und ADAM17 auf die Aktivierung, Rekrutierung und Migration von Neutrophilen und Thrombozyten-Neutrophilen-Komplexen im Rahmen der akuten pulmonalen Inflammation

Abstract

Das ARDS ist ein häufiges Krankheitsbild in der Intensivmedizin, das mit einer Letalität von 25 bis 40% einhergeht. Pathophysiologisch liegt dem ARDS eine akute pulmonale In- flammation zugrunde, die das Lungengewebe neben den auslösenden Faktoren schwer schädigt und zu einer deutlichen Funktionseinschränkung führt. Ein besseres Verständnis der pathophysiologischen Abläufe und der Immunantwort ist entscheidend, um neue thera- peutische Ansätze gezielt entwickeln zu können. Inflammatorische Prozesse werden durch die Proteasen ADAM10 und ADAM17 beeinflusst, die viele an einer Inflammation beteiligte Substrate spalten. Da diese Spaltung sowohl pro- als auch antiinflammatorische Auswirkun- gen haben kann, ist eine systemische Inhibition der ADAMs für die Grundlagenforschung problematisch und kann auch im klinischen Gebrauch mit Schwierigkeiten verbunden sein. Daher ist das Wissen um zellspezifische Effekte der Proteasen wichtig und muss detailliert untersucht werden. Gegenstand dieser Arbeit war daher die Rolle von neutrophilem und thrombozytärem ADAM10 und ADAM17 auf die Aktivierung, Rekrutierung und Migration von Neutrophilen und PNCs im Rahmen der akuten pulmonalen Inflammation.

Die Bearbeitung des Projektes erfolgte vornehmlich in einem murinen Modell der LPS- induzierten pulmonalen Inflammation. 24 Stunden nach Inflammationsbeginn wurde die Migration von Neutrophilen und PNCs, sowie die Oberflächenexpression der Adhäsions- moleküle durchflusszytometrisch quantifiziert. Weitere Adhäsionsmoleküle wurden immun- histologisch visualisiert und quantifiziert. Vier Stunden nach Inflammationsbeginn wurden die Konzentrationen von Aktivierungsmarkern und Zytokinen in der BAL gemessen, sowie die PCRs mit dem Lungengewebe durchgeführt. Auch die Ermittlung der Permeabililtät mittels Gesamtproteingehalt in der BAL fand vier Stunden nach LPS-Inhalation statt. Die systemische Inhibition der ADAMs erfolgte eine Stunde vor der LPS-Inhalation. Die in vitro Daten wurden mit frisch isolierten humanen Neutrophilen, sowie den Zelllinien H441 und HMEC-1 durchgeführt.

Beobachtet wurde, dass die systemische Inhibition von ADAM10 und ADAM17 in vivo und in vitro, sowie der Knockout beider Proteasen auf Neutrophilen in vivo, die Migration von Neutrophilen und PNCs in den Alveolarraum verringerten, während das Fehlen der ADAMs auf Thrombozyten keinen Effekt auf die Migration hatte. Die Aktivität der Neutrophilen und Thrombozyten wurde lediglich durch ADAM17 verändert. TNFα wurde durch die Knockouts von ADAM10 vermehrt ausgeschüttet, und durch das Fehlen von ADAM17 weniger freige- setzt. In den ADAM10CUP-Tieren war weniger CXCL1 in die BAL ausgeschüttet, die CX- CL2/3-Freisetzung wurde durch alle Knockouts reduziert. Die Adhäsionsmoleküle auf Neu- trophilen, Thrombozyten und PNCs waren in den Knockout-Mauslinien unterschiedlich be- einflusst. Auf Neutrophilen stach die Oberflächenexpression von CD44 und CD62L heraus. CD44 war in den ADAM10CUP-Tieren erhöht und CD62L in den ADAM17CUP-Tieren. Auf Thrombozyten und PNCs fiel auf, dass CD44 in den ADAM10PF4-Tieren stark vermehrt auf der Oberfläche exprimiert wurde. Die mikrovaskuläre Permeabilität wurde durch die Knock- outs nicht beeinflusst, obwohl die Oberflächenexpression endothelialer Adhäsionsmoleküle durch das Fehlen der ADAMs verändert wurde. Zudem konnte beobachtet werden, dass der TNFR1-Signalweg durch die Inhibition der ADAMs aktiviert wurde, wohingegen der TNFR2-Signalweg gehemmt worden ist. Als Ausblick für weitere Forschungsprojekte wur- de die Akkumulation der Neutrophilen in der Lunge in einem Ventilator-induzierten Modell der Lungenschädigung histologisch untersucht. Diese war sowohl nach systemischer Inhi- bition als auch durch alle vier konditionalen Knockouts verringert.

Diese Arbeit zeigt einen Einblick auf die die zellspezifische Wirkung der Proteasen ADAM10 und ADAM17 auf Neutrophilen und Thrombozyten in der akuten pulmonalen Inflammation. Die erhobenen Daten zur Migration, sowie der Aktivierung und Rekrutierung von Neutro- philen durch ADAM10 und ADAM17 stützen aktuelle Studien zu den ADAMs in verschiede- nen inflammatorischen Krankheitsbildern. Besonders ist die detaillierte Untersuchung des Migrationsweges durch Beobachtung der Akkumulation der Zellen in vier Kompartimenten. Außerdem erweitert diese Arbeit aktuelle Studien vor allem im Hinblick auf die Rolle der Thrombozyten und PNCs, sowie die thrombozytären Proteasen. Auch das weitgehend un- erforschte Zusammenspiel von neutrophilem ADAM10 und ADAM17 mit endothelialen Ad- häsionsmolekülen, sowie der Einfluss der Inhibition der Proteasen auf die TNF-Signalwege in Neutrophilen wurde in dieser Arbeit beleuchtet.

Zudem ist dieses Projekt Grundstein für weitere bedeutende Folgeprojekte, in denen endo- theliales ADAM10 und ADAM17, klinisch relevantere Inflammationsmodelle, wie beispiels- weise VILI, und die Wirkungsweise der ADAMs auf molekularer Ebene detaillierter unter- sucht werden können. Damit bildet es einen wichtigen Beitrag zur Grundlagenforschung im Bezug auf das ARDS und ist ein weiterer Baustein hin zu den dringend benötigten kausalen Therapieansätzen gegen das ARDS.