Inhaltszusammenfassung:
Zusammenfassung
Das Gehirn-infiltrierende Wachstum und die hohe Therapieresistenz von Glioblastoma multiforme,
dem häufigsten primären Hirntumor bei Erwachsenen, bedingt eine sehr schlechte Prognose für die
Glioblastom-Patienten mit einem medianen Überleben von unter zwei Jahren. TTFields, eine von der
Firma Novocure in Haifa entwickelte Elektrotherapie mit schwachen (1-3 V/cm) elektrischen 200 kHz
Wechselfeldern, wird bei Glioblastom-Patienten optional adjuvant (nach chirurgischer
Tumorresektion und Radiochemotherapie mit Temozolomid) zusammen mit der Temozolomid
Erhaltungstherapie eingesetzt. Eine multizentrische Studie untersucht derzeit bei Glioblastom-
Patienten den Benefit von TTFields konkomitant zur Radiochemotherapie. Hinweise für eine
radiosensibilisierende Wirkung von TTFields ergaben hierzu in vitro-Daten die mehrheitlich mit dem
Inovitro-System der Firma Novocure an Glioblastom-Zelllinien erhoben wurden. Das Inovitro-System
hat allerdings den Nachteil, dass es systembedingt durch die TTFields-Applikation, nicht aber bei den
Kontrollzellen, die Osmolarität des Zellkulturmediums erhöht, und so nicht zwischen TTFields- und
Osmolaritätseffekten unterschieden werden kann. Ein Ziel dieser Arbeit war daher, ein TTFields-in
vitro-Applikationssystem zu entwickeln, das klinisch relevante Feldstärken ohne
Osmolaritätserhöhung des Mediums appliziert und die beschriebenen tumoriziden und
radiosensibilisierenden Eigenschaften der TTFields an - in diesem Fall - patientenstämmigen
Glioblastomstammzell-anreichernden Kulturen (pGSCs) zu überprüfen.
Molekulares Dipol-Alignment und Dielektrophorese an der Zellteilungsfurche wurden als biologische
Mechanismen der TTFields-Wirkung in der Literatur postuliert, die das Ausbilden des Spindelapparats
während der Mitose bzw. die symmetrische Verteilung von Zellkomponenten während der
Zytokinese behindern. Bemerkenswerterweise können manche Fischarten elektrische Gleich- oder
Wechsel-Felder mit speziellen Organen perzeptieren deren Feldstärken weit unter denen der
TTFields-Therapie liegen. Da hierbei als „molekulare Antennen“ spannungsaktivierte Ionenkanäle und
resultierende Ca2+
-Signale fungieren, und eine TTFields-induzierte Aktivierung von Ca2+
-Kanälen in
einer früheren Arbeit direkt gezeigt werden konnte, untersuchte diese Arbeit als zweites Ziel eine
TTFields-induzierte Aktivierung von IKCa- und BKCa-K+
-Kanälen in pGSCs als weiterer bzw. alternativer
molekularer Mechanismus der Elektrotherapie-Wirkung im Glioblastom.
Sind weitere molekulare Wirk- und/oder Resistenzmechanismen der TTFields-Therapie bekannt,
könnten Patienten über Sensitivitäts- bzw. Resistenzmarker des Glioblastoms für eine TTFields-
Therapie stratifiziert bzw. sensibilisiert werden, letzteres durch pharmakologische Blockade der
identifizierten Resistenzmechanismen. Ein drittes Ziel dieser Arbeit war daher über differentielle
Transkriptom-Analysen, TTFields-regulierte mRNAs in unbestrahlten und bestrahlten pGSC-Kulturen
zu identifizieren, um so Hinweise über weitere TTFields-modifizierte Signalwege zu erlangen.
Das Glioblastom stellt einen immunologisch „kalten“ Tumor dar. Die Patientenprognose korreliert
dabei mit der Anzahl der in den Tumor eingewanderten CD8+ zytotoxischen T-Zellen, wodurch sich
Therapien zur Überwindung der Immunsuppression im Glioblastom anbieten. Auch wenn bisher
klinische Studien hierzu negativ verliefen, untersuchte diese Arbeit als letztes Ziel die Auswirkungen
von TTFields auf die anti-Glioblastom-Immunabwehr exemplarisch an der Lyse von pGSCs durch
CD276-gerichtete CAR-NK-Zellen.
Methodisch wurden aus resezierten Tumorproben pGSC-Kulturen angelegt und bezüglich ihrer
mesenchymal-proneuralen Stammzell-Signaturen und Radioresistenz charakterisiert. TTFields
wurden mit einem neu entwickelten TTFields-Generator unter Temperatur- und Osmolaritäts-
Konstanz zusammen mit ionisierender Strahlung (0, 2, oder 4 Gy) einmal über 24 h, oder fraktioniert
über 5 Tage appliziert. Als Messgrößen wurde das klonogene Überleben in „Limited Dilution Assays“,
der Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur durch Zählen der
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nukleären residualen γH2Ax-Foci in der Immunfluoreszenz sowie die Aktivierung von IKCa- und BKCa K+
-
Kanälen während TTFields-Einzelzell-Applikation im Patch-Clamp-Verfahren analysiert. Die
Funktionen der IKCa- und BKCa K+
-Kanäle für die beobachteten TTFields-Effekte wurde durch
Knockdown mittels siRNA und/oder durch pharmakologische Kanalmodulation definiert.
Transkriptomanalysen wurden mittels RNA-Sequencing (Illumina NovaSeq® 6000) an zwei
ausgewählten pGSC-Kulturen in Abhängigkeit von fraktionierter TTFields-Applikation und Bestrahlung
durchgeführt. Die Analyse von TTFields-modulierten Pathways erfolgte mit dem Online Tool
„NetworkAnalyst“ Version 3.0 (https://www.networkanalyst.ca/). Die Effekte von TTFields auf die
Lyse von pGSC-Kulturen durch CD276-gerichtete CAR-NK92-Zellen wurden in Calcein-Freisetzungs-
Experimenten in Abhängigkeit von gleichzeitiger bzw. vorgeschalteter TTFields-Behandlung der NK-
Zellen determiniert.
Als Ergebnis deutete ein in unterschiedlichen Ausmaßen verringertes klonogenes Überleben der
pGSC-Kulturen auf die tumorizide Wirkung einer ein- bzw. fünftägigen TTFields-Behandlung. Anders
wie in der Literatur beschrieben, erhöhten TTFields in den pGSC-Kulturen die Überlebensfraktion
nach Einzel- und fraktionierter Bestrahlung. Diese Radioresistenz-vermittelnde Wirkung ging in einer
von zwei daraufhin getesteten pGSC-Kulturen mit einer erniedrigten Anzahl von residualen nukleären
γH2Ax-Foci 24 h nach Bestrahlung einher, indikativ für eine TTFields-induzierte Verbesserung der
DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in dieser Kultur. Signifikante TTFields-assoziierte Veränderungen
des Zellzyklus wurden weder in Kontroll- noch in bestrahlten pGSC-Kulturen beobachtet.
Akute TTFields-Einzellzell-Applikation erhöhte in zwei von zwei daraufhin untersuchten pGSC-
Kulturen die Aktivität von Ca2+
- aktivierten IKCa K+
-Kanälen. Inhibition der IKCa Kanäle mit TRAM-34
verstärkte die tumorizide in zwei und erniedrigte die Radioresistenz-vermittelnde TTFields-Effekte in
einer von jeweils drei getesteten pGSC-Kulturen. Hemmung der BKCa K+
-Kanäle hatte dagegen keinen
Einfluss auf die tumorizide und Radioresistenz-vermittelnde TTFields-Wirkung.
Transkriptomanalysen zweier ausgewählter pGSC-Kulturen deuteten auf TTFields-regulierte
Transkripte hin. Übereinstimmungen zwischen beiden Kulturen ergaben sich hierbei nur nach
fraktionierter Bestrahlung für USP6NL (Ubiquitin-Specific Protease 6 n-Terminal-like Protein), einem
Regulator von monomeren GTPasen der Ras-Superfamilie. Anreicherungsanalysen von
Signaltransduktions-Netzwerken prognostizierten für beide pGSC-Kulturen verschieden TTFields-
modifizierte Signalwege wie z.B. Wnt-Signalling. jeweils in unbestrahlten als auch in und fraktioniert
bestrahlten Kulturen Überschneidungen nur in verschieden Signalwegen.
Letztlich zeigten die Analyse der pGSC-Zelllyse durch CD276-gerichtete CAR-NK-Zellen, dass TTFields-
Vorbehandlung der CAR-NK-Zellen keinen Einfluss auf die Lyse, TTFields Applikation während der
CAR-NK/pGSC-Kokultivierung eine leichte Steigerung der pGSC-Lyse hervorruft.
Aus den funktionellen und Transkriptom-Daten lässt sich schlussfolgern, dass die individuellen
patientenstämmigen und stammzellangereicherten Glioblastom-Zellkulturen unterschiedlich auf
klinisch relevante TTFields-Elektrotherapie reagieren. Die hier beobachteten Radioresistenz-
erhöhende Effekte der TTFields sprechen gegen eine Kombination von TTFields mit der fraktionierten
Radiotherapie in der Klinik. Sowohl bei der tumoriziden als auch der Radioresistenz-erhöhende
Wirkung könnten Ca2+
-aktivierte IKCa K+
-Kanäle beteiligt sein. Für Letzteres wurde eine funktionelle
Signifikanz von IKCa für die Radioresistenz des Glioblastoms und weiteren Tumorentitäten in der
Literatur berichtet. Mechanistisch könnte in manchen pGSC-Kulturen eine verbesserte DNA-
Doppelstrangbruch-Reparatur zur TTFields-induzierten Radioresistenz beitragen. Auch wenn hier mit
den CAR-NK-Zellen ein sehr artifizielles Modell einer anti-Glioblastom-Immunantwort verwendet
wurde, so sprechen die pGSC-Lyse-Daten zumindest nicht gegen eine Kombination von TTFields und
zukünftig möglicher Immuntherapie.
Tumor Treating Fields (TTFields)