Inhaltszusammenfassung:
Zur Etablierung einer einfach anwendbaren Multiplexing Methode an großen Cryo-Schnitten sollten in einem experimentellen Projekt mehrere Ansätze miteinander verglichen und optimiert werden. Dafür wurden drei verschiedene Antikörper-Entfernungsmethoden getestet. Diese Methode wurde um eine weitere Technik zur Reduktion der Autofluoreszenz ergänzt.
Auf Grundlage dieser Multiplexing Methode strebte die Arbeit die indirekte Immunhistochemie-Färbung von mehr als vier verschiedenen Markern an einem Nasenlängsschnitt mit respiratorischem Epithel (RE) und olfaktorischem Epithel (OE) an. Dadurch sollte eine detaillierte Untersuchung der Proteinexpressionen am RE und OE möglich sein. Für die Etablierung der unterschiedlichen Methoden standen kleinere (zwischen etwa 3 – 10 Millimeter breit und hoch) humane Gewebeproben mit RE und große (etwa 21 x 33 Millimeter) isolierte Nasenlängsschnitte mit RE und OE zur Verfügung.
Die Versuche zur Autofluoreszenz-Reduktion zeigten an kleinen Cryo-Schnitten mit RE die vielversprechendsten Ergebnisse bei der Anwendung von 0,3 % (w/v) Sudanschwarz in 70 %-igem Ethanol für 3 – 5 Minuten, mit Waschschritten in Ethanol und PBS. Einige Quellen zeigen vergleichbare Ergebnisse an anderen Gewebetypen. Für die größeren Nasenlängsschnitte ergab sich eine – in der Inkubationszeit und/oder in der Konzentration – reduzierte Sudanschwarz-Anwendung zur Reduktion der Autofluoreszenz bereits als ausreichend. Es wurde festgestellt, dass an den Nasenlängsschnitten auf eine Autofluoreszenz-Reduktion verzichtet werden konnte.
Als effizienteste Antikörper-Entfernungsmethode für die Anwendung am RE stellte sich die BME/SDS-Lösung für 30 Minuten im Wasserbad heraus. Ähnliche Ergebnisse sind bereits von anderen Autoren beschrieben worden. Nahezu alle Antikörper-Farbsignale sowie die Sudanschwarz-Reste auf den Schnitten konnten erfolgreich entfernt werden. Zudem konnte nach mehrfacher Verwendung der Lösung keine Störung der Gewebeintegrität festgestellt werden. Die BME/SDS-Lösung als effektive Antikörper-Entfernung für einen Multiplexing Ansatz konnte für die Anwendung am OE bestätigt und optimiert werden.
Die optimierte Multiplexing Methode für Nasenlängsschnitte wurde in zwei finalen Durchgängen am OE angewendet. Dabei konnten im ersten Ansatz in drei Runden neun Marker und im zweiten Ansatz in vier Runden zwölf Marker gefärbt werden. Von den unterschiedlichen Markern konnten zehn als positiv nachgewiesen werden, wovon sich wiederum acht positiv am OE darstellten. In Test-Ansätzen waren mit der optimierten Multiplexing Methode sogar bis zu fünf Färbrunden hintereinander an einem Schnitt möglich.
An den Basalzellen der Epithelien zeigte sich das Keratin 5 (K5) positiv. E-Cadherin veranschaulichte die Zellgrenzen der Epithelzellen, wohingegen sich Collagen IV spezifisch an der Basalmembran finden ließ. Die olfaktorischen Rezeptorneurone konnten mit dem olfaktorischem Marker-Protein (OMP) und beta-Tubulin III dargestellt werden. Das Signal des Lektins Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) war an intraepithelialen Zellen (wahrscheinlich den Bowman-Drüsen) und apikal am OE (wahrscheinlich der Schleimschicht) lokalisiert. Diese Expression konnte in anderen Studien ebenfalls bereits nachgewiesen werden, jedoch nicht an humanem Gewebe. Die dortige Funktion des UEA1 müsste, auch im eventuellen Zusammenhang mit pathologischen Prozessen, erst weiter erforscht werden. Annexin 1 (ANXA1) und Annexin 5 (ANXA5) konnten beide an den Zilien des OE, allerdings mit unterschiedlichen Expressionsmustern gezeigt werden. Hierbei fiel insbesondere der Unterschied im Expressionsmuster von ANXA5 zwischen RE und OE auf. Dies könnte ein Hinweis auf funktionelle Differenzen des Proteins an den beiden Epithelien sein. Eine derartige Beschreibung findet sich bisher nicht.
Die aus den einzelnen Stufen erfolgreich entwickelte Multiplexing Methode ergibt einen einfachen, kostengünstigen und gewebesparenden Ansatz zur Untersuchung vieler Marker an einem Cryo-Schnitt. Dies bietet die Möglichkeit grundlegende und variable Proteinexpressionen im RE und OE detektieren zu können, um weitere Erkenntnisse über diese Epithelien zu erlangen.
