Inhaltszusammenfassung:
Die Spinocerebelläre Ataxie Typ 3 (SCA3) ist eine neurodegenerative, genetisch bedingte
Erkrankung aus dem Formenkreis der Polyglutamin-Erkrankungen. Die zugrunde
liegende Mutation ist eine Expansion der CAG-Sequenz im zugehörigen Ataxin-3 Gen,
durch welche im entsprechenden Protein eine Polyglutamin-Kette entsteht. Diese
beeinflusst die Proteinfaltung so, dass es zu Proteinaggregaten in verschiedenen
motorischen Zentren des Gehirns wie dem Cerebellum, dem Hirnstamm und den
Basalganglien kommt. Diese Aggregate scheinen zur Neurodegeneration beizutragen,
welche im Verlauf auftritt. Dies bewirkt einen Koordinationsverlust, der innerhalb von
10-15 Jahren zur Immobilität führt. Die PatientInnen versterben vor allem an
Aspirationspneumonien und Infektionen. Aktuell stehen nur symptomatische Therapien
zur Verfügung, wie intensive Physiotherapie oder Medikamente aus dem Bereich der
Parkinsonbehandlung. Zur kausalen Behandlung werden daher Gentherapien immer
attraktiver.
In dieser Promotion wurden zwei Ansätze mit Antisense-Oligonukleotiden (ASOs)
getestet, die die mRNA des Ataxin-3 binden und mittels Rekrutierung der RNAseH1
abbauen sollten, sodass konsekutiv auch das Protein Ataxin-3 herunterreguliert werden
sollte. Dafür wurde das SCA3 WT/YAC84Q-Mausmodell verwendet, da dieses den
humanen Genlocus des Ataxin-3 mit allen regulatorischen Elementen exprimiert. Der
erste Ansatz wurde allel-unspezifisch entwickelt, sodass die ASOs sowohl das mutante
als auch das wildtypische ATXN3 regulieren sollten. Dies ist vertretbar, da sich in
Tiermodellen gezeigt hat, dass ATXN3 für eine normale Zellfunktion nicht obligat zu
sein scheint. In einem zweiten Ansatz wurden allel-spezifische ASOs getestet, die den
Polymorphismus c.987G>C binden. Dieser ist mit der CAG-Sequenz assoziiert und liegt
bei 70% der PatientInnen weltweit vor. Der SNP wird auch in der WT/YAC84Q-Maus
abgebildet. Durch die sogenannte mutASO sollte nur das mutante ATXN3 reguliert
werden, nicht jedoch das wildtypische. Die ASOs wurden im Alter von 7-10 bzw. 10-12
Wochen jeweils mittels intracerebroventrikulärer Injektion in die Gehirne der
Versuchstiere eingebracht, um durch die Liquorzirkulation im ZNS verteilt zu werden.
Nach 7 bzw. 4 Wochen wurden die Gehirne präpariert. Im Falle der allel-unspezifischen
ASOs wurden die Expressionslevel der RNA des mutanten ATXN3 mittels qRT-PCR
bestimmt. In der Studie der allel-spezifischen ASOs wurden die Expressionslevel des
humanen ATXN3 mittels Western Blot analysiert. Außer für die allel-unspezifische ASO
3 im Frontalen Cortex konnte keine signifikante Regulation beobachtet werden. Als
mögliche Erklärungen ist besonders auf die genaue Injektionsstelle, die chemischen
Modifikationen, die Generation und die Dosis der ASOs sowie die Zeit zwischen
Injektion und Präparation einzugehen.
Die allel-unspezifischen ASOs wurden gut vertragen. Die meisten beobachteten
Auffälligkeiten zum Gewicht sowie dem Phänotyp konnten ebenso in der Kontrollgruppe
festgestellt werden und schienen daher im Zusammenhang mit dem OP-Verfahren zu
stehen. Im Falle der mutASO dagegen wurde eine starke konzentrationsabhängige
(Neuro-)Toxizität festgestellt. Diese zeigte sich vor allem im Phänotyp durch Tremor und
reduzierte koordinatorische Fähigkeiten, welche im Wirehang-Test auffielen. Als
mögliche Ursache ist auch hier die Injektionstechnik zu diskutieren. Die direkte
Applikation ins Gehirn ist mit einem hohen OP-Risiko und der Gefahr einer
Immunreaktion verbunden. Weiterhin ist ein Zusammenhang zwischen der chemischen
Struktur der ASOs und erhöhter Toxizität beschrieben. Es ist bekannt, dass eine erhöhte
Guanin-Anzahl in der Sequenz der ASO zu einer starken akuten Neurotoxizität führen
kann. Die Toxizität der mutASO entwickelte sich jedoch nicht nur akut, sondern auch
über einige Tage hinweg. Als Erklärung könnte eine systemische Reaktion in Betracht
gezogen werden. Es ist zu diskutieren, ob es zusätzlich zur akuten auch eine langfristige
Neurotoxizität gibt, die so bisher noch nicht beschrieben wurde. Außerdem sind das Alter
und Gewicht sowie die transgene Mauslinie als weitere Faktoren der Toxizität zu
beleuchten. Aktuell werden dazu erste systematische Toxizitätsstudien in Mausmodellen
neurodegenerativer Erkrankungen veröffentlich. Jedoch ist das Wissen über die
Unverträglichkeitsreaktion beim Menschen noch sehr begrenzt.
Zusammenfassend liefern die hier dargestellten Studien potenzielle Hypothesen zur
Klärung der Frage, wieso in vitro vielversprechende Therapieansätze in vivo nicht
wirksam sind. Weiterhin wird die Frage aufgeworfen, wodurch die Toxizität der allel-
spezifischen ASOs genau verursacht wird und besonders wodurch die langfristige
Komponente der (Neuro-)Toxizität bedingt ist. Um diese Fragen abschließend zu klären,
wären weitere systematische Untersuchungen notwendig.
Spinocerebellar Ataxia