Inhaltszusammenfassung:
Seltene Erkrankungen, welche in Europa durch eine Prävalenz kleiner als 1 : 2.000 definiert sind, stellen in ihrer Gesamtheit sowohl eine große sozioökonomische Belastung, als auch eine individuelle Belastung der Betroffenen dar. Seltene Erkrankungen mit genetischem Ursprung sind hierbei ein bedeutende Untergruppe und machen ca. 70 % aus. Die Diagnostikraten der RGDs haben sich im letzten Jahrzehnt seit Einführung der Technologie des Next generation sequencing enorm verbessert, sind aber mit einer Erfolgsrate von ca. 50 % je nach Studiendesign nach wie vor als insuffizient einzustufen. Diese niedrige Diagnoserate äußert sich häufig in einer diagnostischen Odyssee für die Betroffenen und sorgt für eine signifikant schlechtere Gesundheitsversorgung im Bereich der RGDs.
Ein häufiges Problem in der molekulargenetischen Diagnosestellung via NGS stellt nicht die Detektion, sondern die Bewertung von genomischen Varianten auf Pathogenität dar, welches sich in einer hohen Rate an sog. Variants of unknown significance (VUS) äußert. Eine Möglichkeit die VUS pathomechanistisch genauer einzuordnen, stellt die Untersuchung auf Expressions- und Prozessierungsunterschiede im Bereich der prä-mRNA mittels Transkriptom-Analyse dar.
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit der diagnostische Zusatznutzen der Analyse der Gesamtheit der mRNA zusätzlich zu einer Reanalyse der NGS-Daten untersucht und durch weiterführende Untersuchungen im Forschungslabor ergänzt. Ziel war im Idealfall eine Klassifizierung der Kandidatengene als pathogen oder wahrscheinlich pathogen. Vor- und Nachteile dieser diagnostischen Pipeline wurden herausgearbeitet.
16 bisher molekulargenetisch ungelöste Fälle wurden im Kontext dieser Arbeit erneut qualitativ ausgewertet. Die NGS-Sequenzierungen und bioinformatischen Aufarbeitungen der Rohdaten wurden nach institutsinternem Standard durchgeführt. Anschließend wurden diese Daten mittels strukturierter Filterungsschritte auf potenzielle Kandidatengene ausgewertet. Eine Validierung eines Spleißdefektes mittels cDNA-Synthese und anschließender PCR, sowie der qualitative und semiquantitative Nachweis von Kandidatengenen mittels Western Blots wurden in Bezug auf spezifische Kandidatengene im hauseigenen Forschungslabor durchgeführt. Hierfür wurden Primäre Fibroblastenzelllinien kultiviert.Kandidatengene konnten in 10 von 16 Fällen der hier vorgestellten Kohorte etabliert werden. In 40 % ergaben sich durch die RNA-Seq Befunde, welche den Verdacht bezüglich eines Kandidatengens erhärteten. Bei drei Individuen sorgte die RNA-Seq für die Etablierung eines neuen Kandidatengens. Für zwei Individuen wurden Western Blots durchgeführt. Es gelang der Nachweis einer deutlich hypomorphen Mutation in Patientenzellen passend zum Kandidatengen DBR1. Des Weiteren konnte ein Spleißdefekt im Gen OSCP1 validiert werden und bei einer weiblichen Betroffenen mittels Kombination aus Trio-WES und RNA-Seq eine gestörte X-Inaktivierung sowie reduzierte Expression vor dem Hintergrund einer Mutation in HUWE1 nachgewiesen werden. Diese Variante wurde schließlich neu als wahrscheinlich pathogen klassifiziert.
Vor diesem Hintergrund bleibt festzustellen, dass die vorgestellte Pipeline sich nach aktuellem Wissensstand sehr gut eignet, um Kandidatengene zu finden und weitere Evidenz für eine mögliche Pathogenität zu ergänzen. Problematisch scheint nach wie vor die Konsequenzen auf den menschlichen Organismus einer VUS vorherzusagen, vor allem wenn für ein Kandidatengen bisher keine diagnostischen Tests etabliert sind. Nächste Schritte für die hier vorgestellten Fälle könnten daher in einer Prüfung auf mögliche funktionelle Analysen, regelmäßige Reanalysen vor dem aktuellen wissenschaftlichen Kontext und Datenaustausch mit anderen humangenetischen Instituten liegen.
Als kritisch in Bezug auf die Forschung zu RGDs werden die in dieser Arbeit diskutierten Themen rund um Phänotypisierung, Standard-Pipelines, Aufbau von funktioneller Evidenz und somit Ausbau des Verständnisses von neuen Krankheitsmechanismen gesehen, um in Zukunft die medizinische Versorgung von PatientInnen mit RGDs nachhaltig zu verbessern.
