Generation of novel pristinamycin I derivatives by mutasynthesis

Abstract

Die Findung neuer Antibiotika ist die wichtigste Strategie, um die Bedrohung für die menschliche Gesundheit durch die zunehmende Verbreitung von Antibiotikaresistenzen unter pathogenen Mikroorganismen zu bekämpfen. Ein Ansatz hierfür stellt die Veränderung der chemischen Struktur bewährter Verbindungen dar, um beispielsweise ihre generelle Wirksamkeit als Antibiotika zu verbessern oder bestimmte Resistenzmechanismen gegen sie zu umgehen. Ein solcher Ansatz, die so genannte Mutasynthese, kombiniert die selektive Zufütterung von Antibiotika-Vorstufen mit der genetischen Veränderung eines ursprünglichen Produzentenstamms. Gewünschte Eigenschaften können so in komplexe Verbindungen eingebracht werden. Da die gentechnischen Veränderungen auf Gene abzielen, welche an der Synthese spezifischer Vorstufen beteiligt sind, kann die Mutasynthese nur angewandt werden, wenn der genetische Hintergrund der jeweiligen Synthesewege verstanden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das Streptogramin-Antibiotikum Pristinamycin, eine Kombination aus zwei synergistisch wirkenden Proteinbiosynthese-Inhibitoren, welches als Notfallantibiotikum gegen Methicillin- und Vancomycin-resistente Krankheitserreger eingesetzt wird. Resistenzen gegen Pristinamycin gefährden jedoch den Einsatz gegen diese Erreger. Als ersten Schritt erweitert diese Arbeit den Forschungsstand über die Diversität von Streptogramin-Biosynthese Gencluster im Allgemeinen. Zu diesem Zweck wurden die Streptogramin-Biosynthese-Gencluster mehrerer Produzenten miteinander verglichen. Dieser Vergleich umfasste aus der Literatur bekannte und charakterisierte Cluster, kürzlich entdeckte aber noch unerforschte Cluster sowie ein Cluster aus Streptomyces kurssanovii, eine Art, welche in dieser Arbeit als Streptogramin-Produzent identifiziert wurde. Der Vergleich zeigt, dass Cluster welche für die Synthese derselben Verbindungen kodieren, in großen Teilen sehr ähnlich sind. Dies verdeutlicht, dass die Struktur der zuvor beschriebenen Cluster auch in anderen Produzenten konserviert ist. Zudem wurde Pristinamycin I, die Streptogramin-B-Komponente von Pristinamycin, durch Mutasynthese modifiziert. In dieser Arbeit wurden zwei neue halogenierte und bioaktive Derivate von Pristinamycin I hergestellt und aufgereinigt. Die Strukturen der neuen Derivate wurden mittels NMR aufgeklärt und ihre allgemeine antimikrobielle Wirksamkeit sowie ihre Wirkung auf Streptogramin-resistente Organismen erwiesen sich als vergleichbar mit der von natürlichem Pristinamycin I.

Procurement of new antibiotics is the main way of fighting the threat to human health posed by the increasing prevalence of antibiotic resistances amongst pathogenic microorganisms. One way to obtain new antibiotics is to modify the chemical structure of proven compounds to, for example, improve their overall effectiveness as antibiotics or to circumvent specific resistance mechanisms against them. One such approach, termed mutasynthesis, combines selective precursor feeding with genetic modification of an original producer strain to introduce desired features into complex compounds. Since the genetic modifications target genes involved in the supply of specific precursors, mutasynthesis can only be employed by understanding the genetic background of the respective synthesis pathways. This work is focused on the streptogramin antibiotic pristinamycin, which is a combination of two synergistically active protein synthesis inhibitors, used as an antibiotic of last resort, primarily against methicillin- and vancomycin resistant pathogens. However, resistances against pristinamycin are endangering its use against those organisms. First, our knowledge about the diversity of streptogramin gene clusters, in general, was expanded. To this end, the streptogramin biosynthetic gene clusters from multiple producers were compared. This comparison included clusters described and characterized in literature, recently discovered yet unexplored clusters, as well as one cluster from Streptomyces kurssanovii, which was identified as a streptogramin producer in this work. Clusters, which code for the synthesis of the same compounds, were found to be highly similar in most regions, showing that the structure of previously reported clusters is conserved in other producers. Second, pristinamycin I, the streptogramin B component of pristinamycin, was modified by mutasynthesis. Two new halogenated and bioactive derivatives of pristinamycin I were generated and purified in this study. The structures of the new derivatives were elucidated by NMR, and their overall antimicrobial potency, as well as their effect on streptogramin resistant organisms, were shown to be comparable to that of natural pristinamycin I.