A Role for WIPI2 in Mitophagy

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 20. Januar 2027 !

Autophagy is a conserved intracellular recycling pathway in eucaryotes, which is essential for the maintenance of homeostasis. Dysregulated autophagy is associated with multiple pathologies in humans. The human WIPI proteins WIPI1 through WIPI4 fulfill crucial and individual functions in autophagy. WIPI is short for WD-repeat protein interacting with phosphoinositides and describes their role as PI3P effectors: the ability to bind to PI3P in autophagosomal membranes, but also protein-protein interactions to regulate and foster autophagosome formation. In the first chapter, I show how WIPI2 is involved in mitophagy induced by the multi-kinase inhibitor Sorafenib, which is the therapy standard for advanced hepatocellular carcinomas. Sorafenib induced mitochondrial depolarization and fission. WIPI2 translocated to damaged mitochondria, where mitophagy was activated. In this context, WIPI2 was dephosphorylated at the Ser413 site, which was also affected by mTOR inhibition and mitophagy induction via CCCP. This underexplored phosphosite could be mitophagy-specific and represent a negative regulatory mechanism of WIPI2 and mitophagy via mTOR. In chapter 2, we performed a human kinome screen to identify regulatory networks of the WIPI proteins and found a novel signaling axis for the control of WIPI1. This signaling pathway functions via DDR1, the Abl kinases, then ERK2 and MYC-MAX to inhibit the gene expression of WIPI1 and therefore its function. In addition, we could characterize WIPI1 as an autophagy enhancer, which has implications for lifespan extension. In the next chapter, I describe how we established an autophagy analysis method using immunofluorescence images of GFP-WIPI1 as an autophagy marker, confocal laser-scanning microscopy and automated image analysis with the open-source software CellProfiler. In the final chapter, using giant unilamellar vesicles combined with native protein extracts from cells stably expressing GFP-WIPI2, our CellProfiler method was extended for the analysis of protein-lipid binding.

Autophagie ist ein konservierter intrazellulärer Recyclingweg in Eukaryonten, der essenziell für die Aufrechterhaltung der Homöostase ist. Eine dysregulierte Autophagie wird beim Menschen mit zahlreichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Die menschlichen WIPI-Proteine WIPI1 bis WIPI4 erfüllen entscheidende und individuelle Funktionen in der Autophagie. WIPI ist die Abkürzung für WD-repeat protein interacting with phosphoinositides und beschreibt ihre Rolle als PI3P-Effektoren: die Fähigkeit, an PI3P in autophagosomalen Membranen zu binden, aber auch Protein-Protein-Interaktionen zur Regulierung und Förderung der Autophagosomenbildung zu ermöglichen. Im ersten Kapitel zeige ich, wie WIPI2 am Prozess der Mitophagie beteiligt ist, die durch den Multi-Kinase-Inhibitor Sorafenib ausgelöst wird, der die Standardtherapie für fortgeschrittene hepatozelluläre Karzinome ist. Sorafenib induzierte eine mitochondriale Depolarisierung und Spaltung. WIPI2 kolokalisierte mit beschädigten Mitochondrien, wo Mitophagie aktiviert wurde. In diesem Zusammenhang wurde WIPI2 an Ser413 dephosphoryliert, was auch durch mTOR-Inhibition und Mitophagie-Aktivierung über CCCP beeinflusst wurde. Diese noch nicht erforschte Phosphorylierungssteelle könnte Mitophagie-spezifisch sein und einen negativen Regulationsmechanismus von WIPI2 und Mitophagie über mTOR darstellen. Kapitel 2 behandelt ein menschliches Kinom-Screening durchgeführt, um regulatorische Netzwerke der WIPI-Proteine zu identifizieren, wobei eine neue Signalachse für die Kontrolle von WIPI1 gefunden. Dieser Signalweg funktioniert über DDR1, die Abl-Kinasen, dann ERK2 und MYC-MAX, was die Genexpression von WIPI1 und damit seine Funktion hemmt. Darüber hinaus konnten wir WIPI1 als Verstärker der Autophagie charakterisieren, was Auswirkungen auf die Verlängerung der Lebensspanne hat. Im nächsten Kapitel beschreibe ich, wie wir eine Autophagie-Analysemethode mit Hilfe von Immunfluoreszenzbildern von GFP-WIPI1 als Autophagie-Marker, konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und automatischer Bildanalyse mit der Open-Source-Software CellProfiler entwickelt haben. Im letzten Kapitel wurde unsere CellProfiler-Methode unter Verwendung von Giant Unilamellar Vesicles in Kombination mit nativen Proteinextrakten von GFP-WIPI2 Zellen, für die Analyse der Protein-Lipid-Bindung erweitert.