Inhaltszusammenfassung:
Einleitung: Die Diagnose von Thrombozytenfunktionsstörungen stellt aktuell immer noch eine Herausforderung dar. Hierfür gibt es verschiedene Gründe. Einerseits können die zugrundeliegenden Ursachen für die Funktionsstörungen sehr heterogen sein, andererseits existieren einige Limitationen der bislang etablierten Methoden für die Thrombozytenfunktionsdiagnostik. So bedarf es bei der Lichttransmissionsaggregometrie, dem aktuellen Goldstandard, großer Blutvolumina und die Methode ist nur in Speziallaboren verfügbar. Diese Arbeit fokussiert sich auf die durchflusszytometrische Untersuchung der AKT-Kinase, einer Kinase mit zentraler Rolle bei der Thrombozytenaktivierung, als neue Diagnostikmethode mit vielen Vorteilen wie dem Auskommen mit nur geringen Blutvolumina.
Methoden: Thrombozytenreiches Plasma wurde durch Zentrifugation von Citratblut gesunder Spender hergestellt, zum Teil mit AKT-/Fcɣ-Rezeptor-Inhibitor präinkubiert und anschließend mit verschiedenen Agonisten wie Thrombin-Receptor-Activating-Peptide (TRAP-6), Arachidonsäure, Adenosindiphosphat (ADP) und Kollagen inkubiert. Es folgte eine Permeabilisierung und Färbung mit verschiedenen Antikörpern. Im Anschluss erfolgte die Darstellung des Phosphorylierungsgrades der AKT-Kinase mittels Durchflusszytometer als Maß für die Aktivierung der Thrombozyten. Zum Vergleich wurde in Parallelansätzen die Aktivierung durch bislang etablierte Standardmethoden gemessen. Im zweiten Teil erfolgte die Aktivierung der Thrombozyten durch IgG-Antikörper, isoliert aus mittels HIPA getesteten Patientenseren, bei denen der Verdacht auf eine HIT bestand, unter jeweils verschiedenen Bedingungen nach gleichem Protokoll. Auch hier wurde ein Vergleich mit Standardmethoden durchgeführt.
Ergebnisse: Es zeigte sich bei gesunden Spendern ein signifikanter Anstieg der pAKT-Expression nach Aktivierung mit den verschiedenen Agonisten im Vergleich zur Negativkontrolle. Eine Präinkubation mit AKT-Inhibitor führte dagegen zu einer signifikanten Abnahme der pAKT-Expression verglichen mit dem jeweiligen nicht-inhibierten Ansatz. Der Vergleich mit den Standardmethoden wies ähnliche Ergebnisse auf. Im zweiten Teil zeigte sich ebenfalls nach Inkubation mit den HIT-IgG unter niedrig konzentriertem Heparin ein signifikant höherer Grad der AKT-Phosphorylierung verglichen mit den Negativkontrollen. Gleichermaßen kam es hier zu einer Abnahme nach Präinkubation mit AKT- bzw. Fcɣ-Rezeptor-Inhibitor. Auch korrelierten die Ergebnisse der pAKT-Expression mit den jeweiligen Werten der entsprechenden Standardmethoden.
Schlussfolgerung: Der Aktivierungszustand von Thrombozyten lässt sich mittels durchflusszytometrischer Messung des phosphorylierten Anteils der AKT-Kinase darstellen. Folglich und durch die Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen der Standardmethoden wurde gezeigt, dass die in der Arbeit demonstrierte Methode eine potenzielle Alternative oder Ergänzung in der Thrombozytenfunktionsdiagnostik darstellt mit breitem Einsatzgebiet und vielen Vorteilen wie dem Bedarf an nur geringen Blutvolumina und der Fixierbarkeit der Proben.
function disorder