Establishment of an in vitro model for melanoma cell dormancy through short-term chemotherapy

Abstract

Introduction

Many years after removal of the primary tumor, melanoma patients can face a severe recurrence of the malignancy. The appearing metastases at different organ sites most likely arise by reawakening of “dormant” tumor cells. The survival of the latter is attributed to an induced reversible cell cycle arrest. Although cellular dormancy in tumor cells is already known for decades, in vitro models to investigate the cellular mechanisms of dormancy and late recurrence in melanoma remain to be established. This study aimed to elaborate an in vitro model for cellular dormancy in cutaneous melanoma, recapitulating the latency of recurrence. We hypothesized that Cisplatin induces a stable cell cycle arrest in a subgroup of cells in different melanoma cell lines and further assumed this cell cycle arrest as being reliably reversible upon the addition of a specific stimulus.

Methods

The establishment of our in vitro model included the optimization of the experimental setting and scheme, the analysis for different cell cycle arrest associated characteristics in the surviving cells and exposure of the latter to putatively pro-proliferative stimuli such as conditioned media of proliferating melanoma cells, specific growth factors or components of the extracellular matrix.

Results

A cell cycle arrest was induced by treatment with Cisplatin in combination with the reduction of fetal calf serum in the medium in three different melanoma cell lines but stability, homogeneity, and reproducibility in the arrest accounted only for SBCL2 cells, treated under specific conditions. One week after therapy removal, all three cell lines showed a G2/M-arrest in the majority of cells in cell cycle analysis by flow cytometry. In surviving SBCL2 cells, this arrest was largely maintained until day 17 of the scheme for short-term chemotherapy. Whereas PCNA expression analysis by immunofluorescence reaction supports the idea of a G2/M-arrest, β-galactosidase staining and morphological characteristics of surviving SBCL2 cells on day 18 of the scheme suggests a senescent phenotype which is commonly associated with a G1-arrest. Neither the application of putatively pro-proliferative stimuli nor the seeding on different components of the extracellular matrix triggered cell cycle-arrested SBCL2 cells into ready re-proliferation.

Discussion and Conclusion

The established in vitro model enables for multifactorial investigation on cellular dormancy over several weeks, reflecting more closely than others the clinical reality of late recurrence. A potent pro-proliferative stimulus reversing Cisplatin-induced cell cycle arrest in our in vitro model remains to be found. Still, the diverse results of this study already encourage widening commonly accepted theories of cellular dormancy in cutaneous melanoma.

Einleitung

Jahre nach der Entfernung des Primärtumors können Melanompatienten einen schweren Rückfall der Erkrankung erleiden. Die sich bildenden Metastasen gehen vermutlich auf wiedererweckte Schläferzellen zurück. Das Überleben dieser wird auf einen induzierten reversiblen Zellzyklusarrest zurückgeführt. Obwohl die Existenz von Schläferzellen seit Jahrzenten bekannt ist, gibt es bisher keine in vitro Modelle, um die zellulären Mechanismen der Schläferzellen im Melanom und ihre Reaktivierung zu untersuchen. Das Ziel dieser Studie war es, ein solches in vitro Modell für Zellschlaf beim kutanen Melanom zu entwickeln, welches zudem die klinische Latenz widerspiegelt. Wir vermuteten, dass Cisplatin in einer Untergruppe von verschiedenen Zelllinien des Melanoms einen stabilen Zellzyklusarrest induziert und gingen weiter davon aus, dass dieser Arrest reversibler Natur ist und bei Zugabe spezifischer Stimuli zuverlässig aufgehoben werden kann.

Methoden

Die Etablierung unseres in vitro Models beinhaltete die Optimierung des experimentellen Versuchsaufbaus und -ablaufs, die Analyse verschiedener Zellzyklus assoziierter Eigenschaften der überlebenden Zellen und die Stimulation letzterer mit mutmaßlich pro-proliferativen Faktoren wie beispielsweise konditionierten Medien proliferierender Melanomzellen, spezifischer Wachstumsfaktoren und Komponenten der extrazellulären Matrix.

Ergebnisse

Durch Behandlung mit Cisplatin in Kombination mit einer Reduktion des Fetalen Kälberserums im Nährmedium konnte in drei verschiedenen Melanomzelllinien ein Zellzyklusarrest induziert werden, jedoch war dieser lediglich bei der SBCL2 Zelllinie und unter spezifischen Bedingungen stabil, homogen und reproduzierbar. Eine Woche nach Beendigung der Therapie zeigte die Zellzyklusanalyse in der Durchflusszytometrie einen Arrest in der G2/M-Phase bei der Mehrzahl der Zellen aller drei Zelllinien. In den überlebenden SBCL2 Zellen wurde dieser Arrest größtenteils bis Tag 17 des Schemas für „short-term chemotherapy“ aufrechterhalten. Während die PCNA-Expressions-analyse durch Immunfluoreszenz die Idee eines G2/M-Arrests unterstützt, deutet die β-Galactosidasefärbung der an Tag 18 des Schemas überlebenden SBCL2 Zellen in Richtung des seneszenten Phänotyps, welcher eher mit einem G1-Arrest assoziiert wird. Weder die Applikation mutmaßlich pro-proliferativer Stimuli noch die Aussaat auf verschiedenen Bestandteilen der extrazellulären Matrix konnten zellzyklusarretierte SBCL2 Zellen zur Re-Proliferation anstoßen.

Diskussion und Schlussfolgerung

Das etablierte in vitro Model ermöglicht eine vielseitige Untersuchung von Schläferzellen über mehrere Wochen. Mehr als andere Modelle kann dies die klinische Realität später Rückfälle abbilden. Ein wirksamer Stimulus zur Reaktivierung des Cisplatin-induzierten Zellzyklusarrests bleibt zu entdecken. Dennoch regen die vielfältigen Ergebnisse dieser Arbeit bereits dazu an, die weithin akzeptierten Theorien zu Schläferzellen im kutanen Melanom zu überdenken.