Inhaltszusammenfassung:
Die hereditäre Hämochromatose Typ I ist eine monogenetische Erbkrankheit, bei welcher eine Mutation im HFE-Gen zum dysfunktionalen Protein führt. Dies verursacht bei den Patienten eine Eisenspeichererkrankung mit vielgestaltigen sowohl unspezifischen systemischen Symptomen wie Fatigue und Lethargie als auch organspezifischen Symptomen insbesondere der Leber (Leberzirrhose, HCC), des Herzens (Kardiomyopathie, Herzrhythmusstörungen), des Pankreas (Diabetes mellitus) und der Haut (Hyperpigmentierung). Bis heute entspricht der regelmäßig durchgeführte Aderlass der Standardtherapie. Dieser kann jedoch aufgrund seines Nebenwirkungsprofils nicht bei allen Patienten angewandt werden. Einen alternativen Therapieansatz stellt die vielversprechende mRNA- basierte Proteinersatztherapie dar, für die im Rahmen dieser Arbeit erste grundlegende in-vitro Experimente durchgeführt wurden. Hierfür wurde ein Transfektionsprotokoll zur Induktion der Synthese eines funktionalen HFE- Proteins in einer Hepatozyten-Zelllinie (HepG2) erarbeitet. Die Herstellung einer Homeostatic Iron Regulator (HFE)-kodierenden mRNA erfolgte mittels In vitro Transkription (IVT). Im Anschluss an die Transfektion von HepG2-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an HFE-mRNA erfolgten die Analyse der Zellviabilität (Presto-Blue-Assay) sowie der Immunantwort (qRT-PCR) und die Bestimmung der mRNA-Aufnahme in die Zelle (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie), der Protein-Expression (Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie) sowie der Funktionalität des HFE-Proteins (qRT-PCR). Es konnte bei HepG2-Zellen nach Transfektion von maximal 1,0 μg HFE-mRNA eine Zellviabilität > 90 % nachgewiesen werden. Bei diesen mRNA-Konzentrationen kam es zu keiner signifikanten Erhöhung der Immunmarker-Expression auf Transkriptebene. Anhand fluoreszenz- markierter HFE-mRNA konnte gezeigt werden, dass die mRNA erfolgreich in die Zellen aufgenommen wurde. Anschließend wurde mit einem Phycoerythrin (PE)-gekoppelten HFE-Protein-AK bestätigt, dass die HFE-mRNA zum HFE- Protein translatiert wird. Weiterhin wurde die Funktionalität des gebildeten HFE- Proteins anhand der induzierten Hepcidin Antimicrobial Peptide (HAMP)- Synthese analysiert, da Hepcidin als zentraler Eisenregulator im menschlichen Körper fungiert. Nach Herbeiführen eines künstlichen Eisenüberschusses (Holo-Tf) für 4 h stieg die HAMP-Synthese tendenziell in den mit HFE-mRNA transfizierten Zellen. Abschließend wurden Herstellungsverfahren (Filmmethode, Mikrofluidik) für die Generierung lipid-basierter Transportvehikel erarbeitet. Dabei wurden verschiedene Lipidverhältnisse und -kombinationen sowie diverse N/P- Verhältnisse gewählt und mittels Transfektionen von eGFP- oder Cy3-HFE- mRNA an HEK293-Zellen getestet. Die Analyse der Komplexierung erfolgte mittels 1 %-Agarose-Gelelektrophorese und der Nachweis der Cy3-HFE-mRNA bzw. des eGFP-Proteins mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. Es konnte gezeigt werden, dass die mittels Filmmethode generierten 100 nm Liposomen aus Stearylamin/ hydriertem Phosphatidylcholin/ Cholesterin eine höhere Komplexierungsrate der verwendeten eGFP-mRNA sowie 48 h nach der Transfektion eine höhere Anzahl an eGFP-positiven Zellen im Vergleich zu den mit 50 nm Liposomen transfizierten Zellen aufwiesen. Die Komplexierung von Cy3-HFE-mRNA mit 100 nm Liposomen zeigte, dass die mRNA erfolgreich in die Zellen aufgenommen wird. Zudem zeigten die Zellen mit einer höheren Konzentration an mRNA oder einer längeren Inkubationsdauer auf den Zellen einen höheren Anteil an Cy3-HFE-mRNA-positiven Zellen. Diese Arbeit präsentiert erste Grundlagenexperimente für die Entwicklung einer innovativen, vielversprechenden Therapiestrategie, welche in ihrem Prinzip auf alle monogenetischen Proteindefekt-Erkrankungen angewandt werden kann.
