Inhaltszusammenfassung:
Kardiale Sphäroide und künstlich hergestellte Gewebe haben sich in den letzten Jahren als mögliche Alternativen zu Tiermodellen für die kardiovaskuläre Forschung und Arzneimittelentwicklung etabliert. Herkömmliche Sphäroidmodelle können jedoch die im natürlichen Herzgewebe beobachtete Zellorganisation nicht genau nachbilden. Auch bei Herzmodellen mit in Hydrogelen eingebetteten Zellen ist es schwierig, die für In vivo-Gewebe charakteristische hohe Zelldichte zu erreichen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wurden Organ-on-a-Chip-Plattformen entwickelt, die das Konzept der Nährstoffperfusion einführen, um das menschliche Gefäßsystem zu imitieren und eine genauere Rekapitulation der physiologischen Bedingungen zu erreichen.
Mit dem Konzept "das Beste aus den Proben herausholen" im Hinterkopf wollten wir ein Heart-on-Chip -Modell entwickeln, das ein nicht-invasives Repertoire an Techniken für die Analyse der Funktion lebender Gewebe und ihres Stoffwechsels bietet. In dieser Dissertation wird eine innovative Heart-on-Chip-Plattform vorgestellt, die für die robuste 3D-Gewebeerzeugung von kontraktilem Gewebe konzipiert wurde. Für die Herstellung von Herz- und Skelettmuskelgewebe wurden zwei verschiedene Zellinjektionsverfahren verwendet.
Der ursprünglichen Zentrifugal-HoC-Plattform mangelte es an Robustheit bei der Beladung von Sphäroiden und Hydrogelen. Daher wurde eine neue HoC-Plattform mit der Bezeichnung Spheroflow HoC entwickelt. Spheroflow HoC ermöglichte eine robuste Beladung mit Sphäroiden, war aber, aufgrund der hohen Viskosität und der schnellen Gelierung von Hydrogelen während der Injektion, nicht mit der gemeinsamen Beladung von Hydrogelen und Sphäroiden kompatibel. Nichtsdestotrotz erwies sich die Strategie als erfolgreich für die Einzelzell-Beladung des Systems mit Skelettmuskelzellen, die sich vermehren, eine angemessene Zelldichte erreichen und Myotubuli bilden konnten. Dies führte, über einen Differenzierungszeitraum von 10 Tagen, zur Bildung von kontraktilem Gewebe. Zusätzlich zur Kultivierung wurden die Gewebe durch Hellfeld-Videomikroskopie, zur Analyse der Schlagkinetik, und durch Immunfärbung, zur Histologischen Evaluation, charakterisiert. Beide Gewebe wiesen eine strukturelle Organisation auf, die ihren jeweiligen Organen ähnelte, wobei die uniaxiale Ausrichtung durch die Kammergeometrie vorgegeben war. Sie zeigten volle Funktionalität und reagierten auf elektrische Stimulation.
Mit besonderem Augenmerk auf Herzgewebe haben wir nicht-invasive Messungen entwickelt, die zur Untersuchung verschiedener biologischer Fragen eingesetzt werden können. Zu diesem Zweck wurden Elektroden nahtlos in die Spheroflow HoC-Plattform integriert, die eine erfolgreiche elektrische Stimulation sowohl von Herz- als auch von Skelettmuskelgewebe ermöglicht. Darüber hinaus wurden in die Plattform Sauerstoffsensoren integriert, die eine Echtzeitüberwachung des Sauerstoffverbrauchs während der Stimulation ermöglichen. Um die Vielseitigkeit der Plattform zu erhöhen, wurde ein automatisiertes Verfahren zur Injektion von Wirkstoffen und Ablesung der Messverfahren eingeführt. Diese Innovation erleichterte nicht nur das potenzielle Wirkstoffscreening, sondern auch die Durchführung von Experimenten zur Evaluierung des Zellstoffwechsels direkt im Chip, so dass keine externen Geräte oder Änderungen am Chipdesign für die Verwendung eines externen Gerätes erforderlich waren. Die Plattform war dank ihrer dünnen Glasbodenschicht mit nicht-invasiven hochauflösenden Bildgebungsverfahren kompatibel. Wir waren in der Lage, Gewebekomponenten und signifikante Gewebeveränderungen unter verschiedenen Bedingungen durch Raman-spektroskopische Bildgebung zu erkennen.
Diese Eigenschaften unterscheiden unser Heart-on-Chip-Modell von den derzeit verfügbaren Modellen und verbessern seine Möglichkeiten zur Untersuchung der Herzphysiologie und des pathologischen Stoffwechsels auf nicht-invasive Weise.
Abstract:
Cardiac spheroids and engineered tissues have risen in the past years as potential alternatives to animal models for cardiovascular research and drug development. Nevertheless, conventional spheroid models fail to accurately replicate the cellular organization observed in native cardiac tissue. Similarly, engineered heart models utilizing hydrogel-embedded cells have struggled to attain the high cell density characteristic of in vivo tissue. Addressing these challenges, Organ-on-a-Chip platforms have been developed with the aim of introducing the concept of nutrient perfusion to mimic the human vascular system and achieve a more accurate reproduction of physiological conditions.
With the concept of “making the most out of your samples” in mind, I aimed to develop a HoC model which provides a non-invasive toolkit of techniques for the analysis of the function of live tissues and their metabolism. This thesis presents an innovative Heart-on-Chip platform designed for robust 3D tissue generation of contractile tissues. Two different cell injection approaches were utilized to create cardiac and skeletal muscle tissues.
The initial Centrifugal HoC platform lacked robustness in the loading of spheroids and hydrogels. Therefore, a new HoC platform was developed, called Spheroflow HoC. Spheroflow HoC provided robust spheroid loading but was incompatible with co-loading of hydrogel and spheroids due to the high viscosity and quick gelation of hydrogels during injection. Nevertheless, the strategy proved successful for single cell loading of skeletal myocytes, which could proliferate, reach adequate cell density, and form myotubules, resulting in contractile tissue over a 10-day differentiation period. In addition to cultivation, the tissues were characterized by brightfield video microscopy for analysis of beating kinetics, and immunostaining to verify tissue morphology. Both tissues exhibited structural organization resembling their respective organs, with uniaxial alignment guided by the chamber geometry. They displayed full functionality and response to electrical stimulation.
With a specific focus on cardiac tissues, I established non-invasive measurements that could be applied to investigate different biological questions. To achieve this, electrodes were seamlessly integrated into the Spheroflow HoC platform, enabling successful electrical stimulation of both cardiac and skeletal muscle tissues. Additionally, the platform incorporated oxygen sensors, allowing real-time monitoring of oxygen consumption during stimulation. To enhance the versatility of the platform, an automated drug injection and readout procedure was implemented. This innovation facilitated not only potential drug screening but also the execution of respirometry analysis directly within the chip, eliminating the requirement for external machines or modifications to the chip design to accommodate the use of an analyser. The platform was compatible with non-invasive high resolution imaging techniques thanks to its thin glass bottom layer. I was able to detect tissue components and significant tissue changes under varying conditions by Raman spectroscopic imaging.
These features distinguish this Heart-on-Chip model from currently available models and enhance its capabilities for studying cardiac physiology and pathology metabolism in a more non-invasive manner.
Organ-on-chip