Fatty Acid Profiling in Pharmaceutical Products by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-based Approaches

Abstract

Zur Gewährleistung der Patientensicherheit ist die Verwendung von geeigneten analytischen Techniken und Methoden zur Charakterisierung unbekannter Veunreinigungen in Wirkstoffen und pharmazeutischen Produkten von immenser Bedeutung. Vor allem Änderungen in Synthese- und Herstellungsprozessen führten in den letzten Jahrzehnten gehäuft zu Skandalen in der pharmazeutischen Industrie, vor allem wenn die Überwachung durch die entsprechende Analytik nicht angepasst wurde. Flüssigchromatographische Techniken wie (Ultra)-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ((U)HPLC) hat sich aufgrund ihrer Vielseitigkeit als Standard für die Analytik über den gesamten „product life cycle“, beginnend mit der Entwicklung bis hin zur Routineanalytik, etabliert. (U)HPLC-Analysen erlauben eine schnelle und effiziente Trennung von Wirkstoffen, Hilfsstoffen und Verunreinigungen. Die Kopplung mit verschiedenen Detektionstechniken, die anhand der chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Analyte ausgewählt und angepasst wurden, ist von großer Bedeutung. Auch wenn die massenspektrometrische (MS) Detektion als Goldstandard und „Lösung für alles“ für viele analytische Probleme angesehen wird, zeigt sich oft die fehlende Selektivität für isobare und isomere Analyte, die keine charakteristische MS2-Fragmentierung zeigen. Ziel dieser Arbeit ist es Konzepte aufzuzeigen, wie die Verwendung unterschiedlicher Derivatisierungstechniken und die Implementierung von orthogonalen stationären Phasen und Detektoren die Identifizierung unbekannter Analyte, durch Erhöhung der Sensitivität und Selektivität, verbessert. Der erste Teil dieser Arbeit zeigt die Relevanz von Oxidationsreaktionen in pharmazeutischen Lipidformulierungen, welche eine große Vielfalt von Oxidationsprodukten generieren. Diese Oxidationsprodukte benötigen eine möglichst umfassende Charakterisierung, da sie als Verunreinigungen klassifiziert werden müssen. Hierfür wurde eine Kombination aus klassischer Umkehrphasen-Säule und einer innovativen chiralen Polysaccharidsäule in einem „full-comprehensive“ zweidimensionalen Flüssigchromatographie-Aufbau entwickelt. Diese Kombination zeigt exzellente Selektivität anhand der dreidimensionalen Struktur der konjugierten Fettsäureisomere, Kompatibilität und Orthogonalität der chiralen und Umkehrphasen-Säule. Diese hohe Selektivität für konjugierte Fettsäureisomere wurde vor allem bei den chiralen Polysaccharidsäulen beobachtet und kann vermutlich auf die komplexe dreidimensionale Struktur der stationären Phasen selbst zurückgeführt werden. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass sich UV- und MS-Detektion komplementär zueinander verhalten, weshalb durch die Kopplung beider Detektoren eine Charakterisierung der Doppelbindungen durch UV-Spektren und die Identifizierung unbekannter Oxylipine durch charakteristische MS2-Spektren möglich war. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Relevanz der Chiralitätsbestimmung in der Verunreinigungsanalytik und in der detaillierten Charakterisierung von biotechnologisch hergestellten Wirkstoffen, am Beispiel von Teicoplanin. Teicoplanin weist eine unterschiedlich starke antibakterielle Wirksamkeit, in Abhängigkeit zur vorliegenden Fettsäureseitenkette, auf. Diese unterscheiden sich bezüglich ihrer Chiralität (bei verzweigten Fettsäuren), Länge und Verzweigung. Mittels moderner chiraler Polysaccharidsäulen und 1-Naphthylamin-Derivatisierung ist die Enantiomerentrennung durch Flüssigchromatographie möglich. Hierdurch wird die Enantiomerentrennung der anteiso-methyl verzweigten Fettsäureseitenkette von Teicoplanin RS3 möglich und durch Verwendung eines selbst-synthetisierten enantiomeren-reinen Standards kann die Stereochemie bestimmt werden. Zusätzlich wird die exzellente Selektivität der chiralen Polysaccharidsäulen für achirale Substanzen anhand der Identifizierung von, zuvor unbekannten, Konstitutionsisomeren gezeigt. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung eines kostengünstigen Workflows zur Doppelbindungspositionsbestimmung mittels Flüssigchromatographie in Kombination mit MS-Detektion. Die Derivatisierung mit Dimethyldisulfid erlaubt den Vorschlag von charakteristischen Fragmenten von (mehrfach) ungesättigten Fettsäuren und verwendete Elektrosprayionisation im negativen Ionisationsmodus. Für höhere Sensitivität und Flexibilität der Methode wurde 2,2‘-Dipyridyldisulfid als Derivatisierungsreagenz eingeführt, welches eine Ionisierung im positiven Ionisationsmodus ermöglicht. Damit können charakeristische Fragmentionen von Omega- und Carboxyende für Fettsäuren mit bis zu zwei Doppelbindungen im positiven Ionisatonsmodus detektiert werden. Diese Methode könnte als Startpunkt für weitere Optimierungen und Untersuchung weiterer Disulfid-basierten Derivatisierungsreagenzien verwendet werden.

Appropriate sensitive and selective analytical techniques and methods are of crucial importance for the in-depth characterization of unknown compounds in pharmaceutical drug substances and products, in order to prevent harm to patient’s health. Even though the power of analytical methods are continuously evolving, unexpected and uncontrolled impurities continue to regularly lead to scandals in pharmaceutical manufacturing and show the ongoing lack of comprehensive quality control of drug substances and products. For this, liquid chromatography in form of (high)-performance liquid chromatography has been established as one of the most versatile analytical techniques in all stages of the product life cycle, from development to routine analysis. (U)HPLC analysis allows fast and efficient separation of drug substances, matrix components and impurities. Coupling with various detection techniques that are precisely tailored to the chemical properties of the respective compounds and analytical task is of utmost importance. Even though, mass spectrometric detection is often considered as the gold standard and all-in-one solution of many analytical problems, it often lacks in selectivity especially for isobaric and isomeric compounds which do not display characteristic fragmentation patterns. Therefore, this work shows how the utilization of different derivatization techniques and the implementation of orthogonal stationary phases and detectors improves identification of unknown compounds by further increasing sensitivity and selectivity. The first part of the thesis shows the significance of lipid oxidation in pharmaceutical lipid formulations, generating a huge variety of oxidation products, which require comprehensive characterization as they are classified as impurities. For this, the combination of commonly used reversed-phase columns with innovative chiral polysaccharide stationary phases in a full-comprehensive two-dimensional liquid chromatography setup was established. This setup shows excellent shape-selectivity for isomers of conjugated fatty acids, compatibility and orthogonality of the used chiral and reversed-phase stationary phases. In this context, chiral polysaccharide columns show immaculate shape selectivity for fatty acid isomers under reversed-phase conditions, probably due to their complex three-dimensional structure. Furthermore, the complementarity of UV-detection to MS-detection is demonstrated, which allows double bond characterization of conjugated fatty acid isomers (distinction of di-, tri-, and tetraenes as well as E/Z isomerism) by UV spectra and identification of unknown oxylipins by characteristic MS2-spectra. The second part displays the importance of chirality-determination for impurity profiling and for in-depth characterization of biotechnologically produced substances like teicoplanin. This has relevance, as for example in case of Teicoplanin, its antibacterial efficacy can be affected by its fatty acid sidechains. State-of-the-art chiral polysaccharide columns in combination with 1-naphthylamine-derivatization make the enantiomeric separation by liquid chromatography feasible. Thus, the enantiomeric separation of the anteiso-methyl branched fatty acid side-chain of Teicoplanin RS3 and hence its stereochemistry determination with custom synthesized standards is possible. Additionally, the excellent selectivity for achiral compounds is presented for the conformation and identification of previously unknown constitutional isomers. The third part is focused in the development of a workflow for the determination of double bond positions by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. The derivatization with dimethyldisulfide allows the proposal of characteristic fragment ions of different (poly)unsaturated fatty acids and utilizes electrospray-ionization in negative mode. To obtain higher sensitivity and flexibility with regard to ionization-modes, 2,2’-dipyridyldisulfide was introduced as derivatization reagent, which allows detection of ω-end and carboxyl-end fragments in positive ion mode of fatty acids with up to two double bonds. This approach could be considered as a starting point for further optimization and investigation of other disulfide-based derivatization reagents.