Inhaltszusammenfassung:
Das Bosch Vivalytic System ist eine automatisierte Lab-on-chip (LoC) Plattform für die molekulare Diagnostik und Probenanalyse am Point of Care ohne den Bedarf eines vollausgestatteten Labors oder geschultem Fachpersonal. Das aktuelle Produktportfolio umfasst Tests für die Analyse von infektiösen Krankheiten. Potenzielle, zukünftige Anwendungen beinhalten Assays für die Krebsdiagnostik und das Therapiemonitoring mittels minimal invasiver Flüssigbiopsie (Liquid Biopsy) und den Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (circulating tumor cells; CTCs) als prognostischen Marker. CTCs lösen sich vom Primärtumor, können in die Blutgefäße gelangen. Sie gelten als Hauptauslöser der Metastasierung und es gibt Hinweise darauf, dass ihre Zahl im Blut mit dem Therapieerfolg korreliert. Quantifizierung der Zellen, die trotz Therapie im Blutstrom verbleiben, stellt eine minimal invasive Methode für das Therapiemonitoring und die Optimierung einer personalisierten Behandlung dar. Die prognostische Bedeutung der CTCs als Biomarker aus Flüssigbiopsien wird zurzeit intensiv erforscht. Da deren Zahl im Blut im Vergleich zu gesunden Blutzellen jedoch gering ist, erfordert die Quantifizierung hochpräzise Methoden.
In dieser Dissertation wird eine Methode für die Analyse von CTCs aus Flüssigbiopsien vorgestellt. Im ersten Schritt der Arbeit wurde eine existierende CTC-Detektionsmethode reproduziert und für die Automatisierung auf einem LoC System angepasst. The etablierte Färbestrategie wurde in einer klinischen Studie (480/2019BO2, Universitätsklinikum Tübingen) mit Patientenproben parallel in zwei Laboren überprüft. Hierbei unterschieden sich die ermittelten absoluten CTC-Zahlen, die Zellzahlverläufe waren jedoch vergleichbar und korrelierten bei drei Patienten mit dem Krankheitsverlauf. Da filtrationsbasierte Methoden für die CTC-Isolation leicht umsetzbar und kompatibel mit dem Vivalytic LoC System sind, wurde im zweiten Schritt eine mikrofluidische Filtrationseinheit im Objektträgerformat entwickelt und Prototypen aus einem transparenten Material gefertigt. Diese dienten als Einzelfunktionsmuster und ermöglichten den Rückhalt von CTCs auf einer optisch einsehbaren Oberfläche, sowie die optische Detektion des Rückhaltevorgangs in Echtzeit. Der Machbarkeitsnachweis (proof-of-principle) erfolgte mit Modellproben durch die Zugabe von geeigneten Tumor-Zelllinien zu gesundem Blut für die Filtration mit Hilfe des Prototyps, währenddessen zurückgehaltene Zellen gezählt wurden, um die CTC-Zahl im Blut zu ermitteln. Die Möglichkeit der Echtzeitdetektion verbesserte die Quantifizierungseffizienz signifikant. Dies galt auch für kleinere Zellen, die initial zurückgehalten wurden, im zeitlichen Verlauf des Vorgangs jedoch durch den Filter hindurchgedrückt wurden. Während die Endpunkt-Quantifizierung zu einer Detektionsrate von 64 % ± 3 % der Zellen führte, konnte die Rate durch manuelle Echtzeit-Zählung auf 84 % ± 4 % gesteigert werden. Für die automatisierte Zellerkennung und -zählung wurde eine Tracking-Methode unter Verwendung von neuronalen Netzen für die Detektion und Segmentierung der Objekte entwickelt. Diese erreichte eine Detektionsrate von 92 % ± 7 % durch die Echtzeit-Zählung in einem Video im Vergleich zu 70 % ± 20 % unter Verwendung des letzten Bildes des Filtrationsvorgangs.
Im dritten Schritt der Arbeit wurde die Filtrations- und Detektionseinheit in die Vivalytic Kartusche integriert. Die Einheitsoperationen für den Flüssigkeitstransport im mikrofluidischen Netzwerk der Kartusche erforderte Anpassung von fluidischen Protokollen für einen schonenden Transport der Zellsuspensionen unter Berücksichtigung von Scherkräften und des verlustfreien Transports unter Erhalt der Viabilität bei > 80 %.
Im vierten Schritt wurden für die isolierten CTCs zusätzlich die Genexpression von exemplarischen EMT (epitheliale mesenchymale Transition) assoziierten Genen untersucht. Die Genexpressionsanalyse des ersten Patienten zeigte eine negative Korrelation des EpCAM-Signals auf der Zellmembran mit der Genexpression von Twist und Snail. Dies könnte einen wichtigen Hinweis auf einen Zusammenhang der Genexpression mit dem klinischen Ausgang darstellen, benötigt jedoch weitere Untersuchung und Validierung mit zusätzlichen Patientenproben.
In zukünftigen Studien sollten die CTCs, die durch die beschriebene Methode detektiert werden, einzeln isoliert und deren Tumorursprung zum Bespiel durch Einzelzell-Sequenzierungsmethoden bestätigt werden. Durch die Reduktion der Probenvorbereitungsschritte und die Möglichkeit der Echtzeit-Detektion, konnte der Zellverlust minimiert und die CTC-Quantifizierungseffizienz optimiert werden.
Die Automatisierung des vorgestellten Assays und die Integration auf die Vivalytic Plattform könnte das System durch eine neue Anwendung für das Krebstherapiemonitoring durch Zählung und Charakterisierung von CTCs erweitern. Dies stellt ein vielversprechendes Werkzeug dar, um die automatisierte und schnelle Point-of-Care-Erfassung von Änderungen der CTC-Anzahl im Blut von Tumorpatienten zu erfassen, die eine Einschätzung des Therapieerfolges ermöglicht.
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