Metformin-induced Effects on Human Skeletal Muscle Metabolism and Function

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 31. Juli 2025 !

Metformin, the primary oral antidiabetic agent for type 2 diabetes (T2D), has been FDA-approved for three decades. Today more than 150 million people worldwide benefit from metformin via effectively reduced blood glucose levels with low risk of hypoglycemia. However, the precise mechanism of action has not yet been conclusively clarified. Skeletal muscle is an important player in insulinmediated glucose uptake, but the number of studies on the effects of metformin on this tissue is limited. This thesis aims to improve the understanding of the effects of metformin on skeletal muscle by investigating two specific questions: 1. What are the molecular mechanisms by which metformin leads to increased lactate production? This phenomenon is associated with the known adverse effects of hyperlactatemia and metabolic acidosis. At the same time, it has been hypothesized that moderate increases in plasma lactate levels may contribute to the pleiotropic beneficial effects of metformin. 2. Which molecular mechanisms provide an explanation for the attenuated muscular adaptations to regular performed physical exercise during metformin therapy as reported in some clinical studies? This question arises in the context that regular exercise is an integral part of T2D therapy and skeletal muscle plays a central role in physical activity. Both questions were addressed by a 48-hour treatment of primary human myotubes with a range of different metformin concentrations (16–776 µM) to cover both pharmacological and suprapharmacological doses of the drug. Global effects were investigated by RNA sequencing analysis. For the determination of lactate production and glucose consumption cell culture supernatant was analyzed. Individual mechanisms were investigated on the basis of immunoblots, immunohistochemistry, respirometry and luminescence assays. Mimicking exercise in vitro, electro-pulse stimulation was applied and cellular energy status was investigated by quantification of adenosine nucleotides via capillary electrophoresis (CE). Increasing concentrations of metformin led to its intracellular accumulation. As from 78 µM, the metformin treatment resulted in a dose-dependent increase in extracellular lactate, predominantly due to increased lactate production covered by increased glucose uptake and glycolysis. Lactate production was forced through a shift in the equilibrium of the LDH reaction in myotubes. First, metformin inhibited mitochondrial respiration in complex I causing a shift in cellular redox state represented by the accumulation of NADH. Second, metformin mediated an accumulation of pyruvate through the inhibition of PDH complex. Which of the two mechanisms is at work in the skeletal muscle of metformin-treated patients with T2D needs to be investigated. Assessing the second question, reduced mTOR-C1/S6K1 signaling was found in metformin-treated myotubes, indicating a blunted hypertrophic response mediated by metformin. In addition, even at low concentrations, metformin impaired the electro-pulse-stimulated contraction of myotubes. No evidence of structural changes could be found, so that this does not appear to be the cause of the limited functionality of the myotubes. The hypothesis that a metformin-induced energy deficit is the underlying cause could not be conclusively confirmed. Nucleotide quantification using CE did not reveal any differences, but in contrast, an increased activation of the energy sensor AMPK was found. In conclusion, the results suggest a novel mechanism by which metformin can increase lactate production through altered activity of the PDH complex. The impaired contractility of metformin-treated myotubes provides in vitro evidence that metformin may interfere with biochemical processes during exercise in vivo. Given the high prevalence of metformin-exercise combination therapies in patients with T2D, further in vivo studies are required.

Metformin ist das wichtigste orale Antidiabetikum zur Behandlung von Diabetes Typ 2 (T2D) und bereits seit drei Jahrzehnten von der FDA zugelassen. Heute profitieren weltweit mehr als 150 Millionen Menschen von einer effektiven Senkung des Blutzuckerspiegels, während gleichzeitig das Risiko einer Hypoglykämie gering ist. Der genaue Wirkmechanismus von Metformin ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. Der Skelettmuskel ist ein wichtiger Akteur bei der Insulin-vermittelten Glukoseaufnahme, dennoch ist die Anzahl an Studien über die Auswirkungen von Metformin auf dieses Gewebe begrenzt. Daher zielt diese Arbeit darauf ab, das Verständnis der Effekte von Metformin auf die Skelettmuskulatur zu verbessern, indem zwei spezifische Fragestellungen untersucht werden: 1. Über welche molekularen Mechanismen induziert Metformin eine erhöhte Laktatproduktion? Dieses Phänomen ist mit den bekannten unerwünschten Nebenwirkungen Hyperlaktatämie und metabolischer Azidose assoziiert. Gleichzeitig existiert die Hypothese, dass moderate Erhöhungen des Plasmalaktatspiegels zu den pleiotropen positiven Wirkungen von Metformin beitragen könnten. 2. Welche molekularen Mechanismen liefern eine Erklärung für die reduzierte Wirksamkeit von regelmäßig durchgeführtem Sport während einer Metformin Therapie, wie dies in einigen klinischen Studien berichtet wurde? Diese Frage stellt sich vor dem Hintergrund, dass regelmäßiger Sport fester Bestandteil der Therapie von T2D ist und die Skelettmuskulatur eine zentrale Rolle bei körperlicher Aktivität einnimmt. Beide Fragen wurden durch eine 48-stündige Behandlung primärer humaner Myotuben mit einer Reihe unterschiedlicher Metforminkonzentrationen (16–776 µM) untersucht, um pharmakologische und supra-pharmakologische Dosen des Wirkstoffes abzudecken. Die globalen Effekte von Metformin auf die Myotuben wurden im Rahmen einer RNA-Sequencing Analyse untersucht. Für die Bestimmung der Laktatproduktion und des Glukoseverbrauchs wurde der Zellkulturüberstand analysiert. Einzelne Mechanismen wurden anhand von Immunoblots, Immunhistochemie, Respirometrie und Lumineszenz Assays untersucht. Zur Simulation von Sport in vitro wurde die Elektropuls- Stimulation angewendet und der zelluläre Energiestatus der Myotuben wurde durch die Quantifizierung der Adenosin-Nukleotide mittels Kapillarelektrophorese (CE) ermittelt. Steigende Konzentrationen von Metformin führten zu dessen intrazellulärer Anreicherung. Ab 78 µM führte die Metformin-Behandlung zu einem dosisabhängigen Anstieg des extrazellulären Laktats, der in erster Linie auf eine erhöhte Laktatproduktion zurückzuführen war, die durch eine erhöhte Glukoseaufnahme und Glykolyse gedeckt wurde. Die verstärkte Laktatproduktion wurde durch eine Verschiebung des Gleichgewichts der LDH-Reaktion bewirkt. Erstens hemmte Metformin die mitochondriale Atmung des Komplex I, was eine Verschiebung des zellulären Redox-Status zur Folge hatte und somit zur Erhöhung der NADH/NAD+ Ratio führte. Zweitens induzierte Metformin die Akkumulation von Pyruvat durch die Hemmung des PDH-Komplexes. Welcher der beiden Mechanismen im Skeletmuskel von mit Metformin behandelten Patienten mit T2D eine Rolle spielt, muss weitergehend untersucht werden. In Bezug auf die zweite Fragestellung wurde in mit Metformin behandelten Myotuben ein verringertes mTOR-C1/S6K1-Signaling nachgewiesen, was eine durch Metformin vermittelte abgeschwächte hypertrophe Antwort erklären kann. Darüber hinaus zeigte die Elektropuls-Stimulation der Myotuben eine beeinträchtigte Kontraktion bereits durch die Behandlung mit niedrigen Metformindosen. Es konnten keine Hinweise auf strukturelle Veränderungen gezeigt werden, so dass hierin nicht die Ursache für die eingeschränkte Funktionalität der Myotuben zu liegen scheint. Die Hypothese, dass ein Metformin-induziertes Energiedefizit die Ursache ist, konnte nicht abschließend bestätigt werden. Die Nukleotidquantifizierung mittels CE ergab keine Unterschiede, wohingegen eine erhöhte Aktivierung des Energiesensors AMPK gemessen wurde. Die Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus hin, durch den Metformin die Laktatproduktion durch eine veränderte Aktivität des PDH-Komplexes erhöhen kann. Die beeinträchtigte Kontraktilität der mit Metformin behandelten Myotuben liefert einen Beweis dafür, dass Metformin biochemische Prozesse während des Trainings beeinträchtigen kann. Angesichts der hohen Prävalenz von Kombinationstherapien aus Metformin und regelmäßigem Sport bei Patienten mit T2D erscheinen weitere in vivo Studien notwendig, um diesem Sachverhalt nachzugehen.