Regulators Influencing the Heterologous Production of Liponucleoside Antibiotics in Streptomyces coelicolor M512

Abstract

Dissertation gesperrt bis zum 17.05.2026!

Die heterologe Expression von Biosynthese-Genclustern ist ein häufig angewandtes Vorgehen in der Naturstoffforschung und erleichtert Untersuchungen der involvierten Gene an der Biosynthese des resultierenden Naturstoffs, sowie die Entwicklung möglicher Strategien zur Produktionssteigerung. Die Auswirkungen globaler Regulatoren des Wirtsstammes auf die Expression eingebrachter Gencluster, sowie die Anpassungen im Stoffwechsel des Wirtsstammes finden jedoch größtenteils kaum Beachtung. Eine vorangegangene Studie deutete auf ein regulatorisches Zusammenspiel zwischen der heterologen Expression der Biosynthesegene von Novobiocin auf der einen Seite, und der Bereitstellung von biosynthetischen Vorstufen aus dem Primärmetabolismus des Wirtes auf der anderen Seite hin. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Regulatoren des heterologen Wirtes, Streptomyces coelicolor M512, zu identifizieren, die mit den eingebrachten Genclustern für die beiden Liponucleosid-Antibiotika Caprazamycin und Liposidomycin interagieren und deren Produktion beeinflussen. Liposidomycine und Caprazamycine werden von verschiedenen Streptomyces Stämmen produziert und wurden Mitte der 1980er bzw. Anfang der 2000er Jahre entdeckt. Beide Liponucleosid-Antibiotika zeigen eine gute Bioaktivität gegen Mykobakterien, bedingt durch ihre ausgeprägten chemisch strukturellen Ähnlichkeiten. Dementsprechend ähneln sich ihre Biosynthesewege, die auf den gleichen biosynthetischen Vorstufen beruhen, sowie die genetische Organisation der entsprechenden Gencluster, die untereinander eine sehr hohe Sequenzhomologie aufweisen. Somit wurde für die heterologen Stämme S. coelicolor M512, mit vollständigem Caprazamycin (cpzLK09) oder Liposidomycin (lpmLK01) Gencluster, auch ein vergleichbares Zusammenspiel zwischen Regulatoren des Wirtes und Promoter-Regionen der eingebrachten Gencluster vermutet. In dieser Arbeit wurden DNA-affinity-capturing assays mit nachfolgender Massenspektrometrie genutzt, um Regulatoren des Wirtsstammes zu identifizieren, die an ausgewählte intergene Bereiche des Caprazamycin- und Liposidomycin-Genclusters binden. Die untersuchten intergenen Bereiche wurden als Promotor-Regionen mittels RNA-Sequenzierung verifiziert. Als Negativkontrolle diente die Promotor-Region des vegetativen Sigma Faktors hrdB, um die Bindungsspezifität beurteilen zu können. Insgesamt wurden jeweils 1906 und 1540 Proteine an den Promotor-Regionen der Gencluster aus S. coelicolor M512/cpzLK09 und S. coelicolor M512/lpmLK01 identifiziert. Von diesen banden nur drei Proteine spezifisch an zueinander gehörige Promotor-Regionen aus beiden Genclustern, was auf Unterschiede hinsichtlich der regulatorischen Wechselwirkung mit dem Wirtsstamm hindeutete. Basierend auf einer spezifischen Bindung, oder aber einer bereits bekannten Beteiligung an der Regulation zur Bereitstellung von Vorläufermolekülen, wurden fünf mutmaßliche Regulatoren für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Von diesen führte die Überexpression von zwei Genen zu signifikant erhöhter Caprazamycin Produktion. Die Überexpression eines cAMP-Rezeptor Proteins, ein Regulator des Leucin-Isovalerat-Abbauwegs, der Vorstufen für die Liponucleosid-Biosynthese bereitstellt, erhöhte die Caprazamycin und Liposidomycin Produktionsmengen signifikant. Der zweite Regulator, der die heterologe Caprazamycin-Produktion beeinflusste, gehört zur Familie der TetR Regulatoren. Obwohl dieses Protein im DNA-affinity-capturing assay spezifisch an einer zueinander korrespondierenden Promotor-Region in beiden Genclustern gebunden hatte, steigerte dessen Gen-Überexpression nur die Caprazamycin- und nicht die Liposidomycin-Produktion. Deshalb wurde die Bindestelle des Regulators in den Promotor-Regionen durch Biolayer-interferometry Messungen genauer bestimmt. Die Positionen der primären Bindestelle sind interessanterweise in beiden Genclustern unterschiedlich: während der TetR-Typ Regulator in der ausgewählten Region des Caprazamycin Genclusters im codierenden Bereich des Strang-aufwärts liegenden Gens cpz9 bindet, bindet er in der Mitte der intergenen Region zwischen lpmG und lpmH aus dem Liposidomycin Gencluster. Dies könnte die unterschiedlichen Effekte auf die Liponucleosid Produktion in beiden heterologen Stämmen erklären. Zusätzlich bot die Identifikation der Bindestellen die Möglichkeit, eine Konsensus-Erkennungssequenz zu bestimmen, die experimentell ebenfalls mit Biolayer-interferometry verifiziert wurde. Eine Genom-weite Suche nach möglichen regulatorischen Zielsequenzen in S. coelicolor mit Hilfe der Konsensus-Sequenz, erbrachte jedoch keine offensichtliche Verbindung zur Liponucleosid Biosynthese oder deren Vorläufermolekülen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde der Fokus auf die Charakterisierung der Cluster-spezifischen Regulatoren des Caprazamycin und Liposidomycin Biosynthese-Genclusters, Cpz9 und LpmG, gelegt. Dafür wurden die entsprechenden Gene, die vermutlich für AraC-ähnliche Aktivatoren codieren, einzeln in den heterologen Produzentenstämmen überexprimiert. Während die cpz9 Überexpression in S. coelicolor M512/cpzLK09 nur eine leichte Erhöhung der Produktivität von Caprazamycinen erbrachte, führte die Überexpression von lpmG in S. coelicolor M512/lpmLK01 zu einer starken, signifikanten Überproduktion von Liposidomycinen. Hierdurch konnte die geringe Expression von lpmG als möglicher limitierender Faktor für die Liposidomycin Produktion im heterologen Expressionsstamm identifiziert werden.