Isolation & characterization of Trace Amines (TAs) producing human skin commensals And Isolation and characterization of L-Forms in Staphylococcus aureus HG001 and JE2 (MRSA)

Abstract

Title: Isolation & characterization of Trace Amines (TAs) producing human skin commensals (Chapter one)

Die Haut dient als natürlicher Lebensraum für eine vielfältige Anzahl von Mikroorganismen, wobei etwa zehn Millionen Mikroben auf jedem Quadratzentimeter feuchter Haut leben. Unter diesen Organismen werden biogene Amine durch die Decarboxylierung aromatischer Aminosäuren produziert, ein Prozess, der von Mikroorganismen, Pflanzen und Säugetieren durchgeführt wird. Innerhalb dieser Kategorie stellen "Spurenamine" eine Gruppe von Monoaminen dar, die sich durch ihre geringe Häufigkeit im Gehirngewebe auszeichnen. Bemerkenswerte Beispiele für Spurenamine, die bei Säugetieren gefunden wurden, sind Tryptamin (TRY), Tyramin (TYM), Phenylethylamin (PEA) und Octopamin (OCT), die als Neurotransmitter oder Neuromodulatoren fungieren. Interessanterweise werden diese Spurenamine nicht nur vom Wirtorganismus produziert, sondern auch von verschiedenen bakteriellen Arten innerhalb der menschlichen Mikrobiota synthetisiert. Studien haben gezeigt, dass die bakterielle Produktion dieser Spurenamine mit adrenergen Rezeptoren interagieren kann, was die bakterielle Invasion in Wirtszellen und Wundheilungsprozesse beeinflusst. Besonders bemerkenswert ist, dass bestimmte Staphylokokkenarten eine staphylokokkale aromatische Aminosäure-Decarboxylase (SadA) mit ungewöhnlicher Spezifität beherbergen.

In dieser Studie hatten wir zum Ziel, das Spektrum der auf der menschlichen Haut lebenden Spurenamin-produzierenden Arten zu analysieren. Unter Verwendung von Proben von 30 Personen haben wir unter aeroben Bedingungen etwa 1909 Hautbakterien isoliert. Die Koloniebildenden Einheiten (KBE) variierten signifikant zwischen den Probanden und reichten von 19x101 bis 1381x103 KBE/cm². Anschließend haben wir die Kultursupernatanten dieser Hautisolaten auf Spurenaminproduktion mittels RP-HPLC analysiert. Unsere Ergebnisse zeigten Spurenamine im Kulturüberstand von 269 Hautisolaten (14%). Des Weiteren haben wir die Spurenaminproduzenten basierend auf ihrer Fähigkeit, ein, zwei oder alle drei Spurenamine zu produzieren, kategorisiert. Durch 16S-rRNA-Analyse haben wir die Isolate in zwei Hauptbakterienfamilien eingeteilt: Staphylococcacae (80%) und Bacillacae (20%). Bemerkenswerterweise wurden staphylokokkale Arten vorwiegend als Produzenten aller drei Spurenamine, einschließlich DOPA, gefunden, während Bakterien aus anderen Gattungen eine größere Vielfalt in der Spurenaminproduktion aufwiesen. Unsere Forschung konzentrierte sich auf Spurenamine, um Einblicke in das Hautmikrobiom zu gewinnen, indem Spurenaminproduzenten von Nichtproduzenten über verschiedene bakterielle Gattungen hinweg unterschieden wurden. Insgesamt trägt unsere Studie dazu bei, das Verständnis für die Rolle der Hautmikrobiota bei der Interaktion mit neuronalen Rezeptoren zu vertiefen.

And

Title: Isolation and characterization of L-Forms in Staphylococcus aureus HG001 and JE2 (MRSA) (Chapter two)

Die L-Formen von Staphylococcus aureus spielen eine Rolle bei rezidivierenden und persistierenden Infektionen. Stabile L-Formen können verwendet werden, um ihr Wachstumsverhalten, Stoffwechsel und Evolution zu untersuchen. Wir planen, solche L-Formen zu verwenden, um den Wirkungsmechanismus von Antibiotika, die die bakterielle Membran und die Zellwand ins Visier nehmen, mittels Fluoreszenzmikroskopie besser zu untersuchen. Bei Gram-positiven L-Formen ist die dicke Zellwand weitgehend verringert, jedoch wissen wir nicht, wie viel der Peptidoglykansynthese intakt ist. In dieser Studie wurden zwei Stämme von Staphylococcus aureus ausgewählt, einer war der gängige Laborstamm HG001 und der andere war der methicillinresistente Stamm JE2 (MRSA). So haben wir in diesem experimentellen Prozess durch Verwendung von Pen G 300 µg/ml für HG001 und 2000 µg/ml für JE2 eine gute Umwandlung in L-Form erreicht. Die erste Aufgabe bestand darin, ein Medium zu optimieren, in dem die Umwandlung in L-Form einfacher, schneller und bequemer ist. Für ein besseres Wachstum und die Vermehrung von L-Formen wurden in dieser Studie zwei Medien optimiert, DM3-Agar und SMMP. Das erfolgreiche Wachstum des zellwanddefekten Zustands von Staphylococcus aureus wurde mit DM3-Agar unter Verwendung der Schicht-für-Schicht-Methode erreicht. Das SMMP-Brümedium konnte durch Zugabe von Antioxidantien verbessert werden, was die Stabilität der L-Formen erhöhte. Im DM3-Agar-Medium wurden charakteristische "Spiegelei"-Kolonien in der Primärkultur und auch in subkultivierten Platten mit Pen G-Behandlung beobachtet. Die L-Formzellen von S. aureus sind größer als die Elternzellen, sie sind pleomorph, z.B. vakuolisiert, knospend oder in proliferativen Formen. Die Zellen in den optimierten Medien wurden auch mittels Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Ein leichter Nachteil besteht darin, dass das Wachstum der L-Form langsamer war als das der Eltern, die Lag-Phase war weitgehend verlängert, aber sie können über einen langen Zeitraum im stabilen Zustand wachsen. Interessanterweise waren die L-Formen von HG001 und JE2 lysostaphinresistent, im Gegensatz zu den Eltern wurden sie offensichtlich nicht lysiert. Zusammenfassend könnten L-Formen ein interessantes Werkzeug darstellen, um die Wirkung von CW- und membranaktiven Verbindungen zu untersuchen.