Activation of NO/cGMP signaling as a potential therapy for metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 19. März 2026 !

Eine der Hauptursachen für durch Lebererkrankungen verursachte Sterblichkeit ist die metabolische disfunktion-assozierte steatotische lebererkrankung (MASLD), die durch übermäßige Kalorienzufuhr in Verbindung mit einem bewegungsarmen Lebensstil verursacht werden kann. Die MASLD umfasst ein Spektrum chronischer Lebererkrankungen, das mit einer Fettleber beginnt und im Laufe der Zeit zu einer metabolische disfunktion-assozierte steatohepatitis (MASH), einer Zirrhose und schließlich zu einem hepatozellulären Karzinom fortschreitet. Das Fortschreiten von MASLD zu MASH beginnt mit der Anhäufung von Lipiden in der Leber (Steatose), gefolgt von der Aktivierung verschiedener leberansässiger Zellen, einschließlich der hepatischen Stellatzellen (HSC). Der Übergang der HSCs von einem ''ruhenden'' zu einem ''aktivierten'' Phänotyp ist ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von MASH. MASH tritt häufig zusammen mit kardiovaskulären Erkrankungen auf, welche von der Atherosklerose herrühren könnten. Zusätzlich zu den Risikofaktoren, die sowohl Atherosklerose als auch MASH beeinflussen, gibt es bereits Hinweise, dass der 3',5'-zyklische Guanosinmonophosphat (cGMP)-Stoffwechselweg einen Einfluss auf beide Krankheiten haben kann.

Die Bildung des sekundären Botenstoffes cGMP durch die Stickstoffmonooxid (NO)-sensitive Guanylylzyklase (NO-GC) ist ein zentraler physiologischer Mechanismus im kardiovaskulären System. Die Bedeutung des NO/NO-GC/cGMP-Signalweges spiegelt sich in der erfolgreichen Behandlung von Erkrankungen wie Herzversagen oder Lungenhochdruck mithilfe von Substanzen, die diesen Signalweg modulieren, wider. Im hepatischen System wurde der NO/NO-GC/cGMP-Signalweg in HSCs beschrieben. Die Pathogenese von Lebererkrankungen wie MASH wird mit einer verminderten Bioverfügbarkeit von NO und einem erhöhten oxidativen Stress in Verbindung gebracht. Oxidativer Stress kann die Oxidation der Häm-Gruppe der NO-GC zufolge haben, wodurch das Enzym nicht mehr durch NO stimuliert werden kann. Im Gegensatz zu NO kann die vor Kurzem entwickelte Klasse der NO-GC Aktivatoren die oxidierte, Häm-freie, NO-GC binden und somit möglicherweise cGMP-Spiegel in erkrankten Lebern erhöhen. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Rolle und pharmakologische Relevanz des NO/NO-GC/cGMP-Signalweges bei MASH zu ermitteln, wobei der Schwerpunkt auf HSCs lag. Insbesondere wurde untersucht, ob ein neuartiger NO-GC-Aktivator von Bayer das Fortschreiten der Krankheit beeinflussen könnte. Um diese Fragen zu ergründen, wurde ein MASH/Atherosklerose Komorbiditäts-Mausmodell etabliert, indem Apolipoprotein E Knockoutmäuse mit einer fettreichen Diät (HFD; von hieran HFD-Mäuse genannt) gefüttert wurden. Die Kerneigenschaften von MASH, einschließlich der Aktivierung von HSCs, wurden mithilfe histologischer Techniken in HFD- und Kontrollmäusen untersucht. Die Expression zentraler Komponenten des cGMP-Signalweges (NO-GC und cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I, cGKI) und weiterer Markerproteine für HSCs (Desmin, α-SMA und SM22) wurde in Lysaten und Schnitten von Lebergewebe mittels Western Blot und Immunfluoreszenzfärbung untersucht. cGMP wurde in Echtzeit in primären HSCs aus Mäusen unter Zuhilfenahme eines Förster-Resonanzenergietransfer-basierten cGMP Biosensors visualisiert. Dabei wurde die räumliche und zeitliche Dynamik von cGMP-Signalen in Antwort auf NO und einem neuen NO-GC Aktivator in primären HSCs an Tag 2 und Tag 8 in Kultur beobachtet. HFD Mäuse wurden mit dem neuen NO-GC Aktivator behandelt (HFD ergänzt mit aktivator), um seinen Effekt auf die Entwicklung von MASH zu untersuchen. Zusätzlich zur Histologie und zu Immunfluoreszenzfärbungen, wurden die Lebern von mit Aktivator behandelten Mäusen einer biochemischen und RNA-Expressionsanalyse unterzogen. HFD-Mäuse haben MASH in Kombination mit der Komorbidität Atherosklerose entwickelt. Im Gegensatz zu Kontrollmäusen wiesen Sie eine Gewichtszunahme und Hepatomegalie zusammen mit dem gesamten Spektrum an Charakteristika für MASH, einschließlich Steatose, Ballooning, Entzündung und Fibrose auf. Die Entwicklung der Fibrose war mit einer Aktivierung von HSCs, gekennzeichnet durch Ausbreitung und erhöhter Expression von α-SMA und SM22, in MASH Lebern verbunden. NO-GC und cGKI waren robust in HSCs, unabhängig von ihrem Aktivierungszustand, exprimiert. Übereinstimmend mit unseren Befunden in vivo, haben sowohl Tag 2 als auch Tag 8 HSCs in Kultur cGMP in Antwort auf NO oder den NO-GC Aktivator gebildet. Besonders bemerkenswert war, dass die Behandlung von HFD-Mäusen mit dem NO-GC Aktivator den MASH Phänotyp verbessert hat. Dies zeigte sich an verringertem Ballooning von Hepatozyten, verringerter hepatischer Fibrose und einem Trend zu reduzierten Leberenzym-Leveln (AST und ALT) und Entzündungsmarkern, wie eine histochemische Analyse (Mac-2 und F4/80) und RT-PCR (TNFa, IL6, IL1A, IFNG, CCL2 und CXCL10) zeigten. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse daraufhin, dass in HSCs der Leber ein funktionierender NO/NO-GC/cGMP-Signalweg existiert und dass seine Komponenten NO-GC und cGKI als HSC-Marker dienen könnten. Interessanterweise könnte die pharmakologische Aktivierung dieses Signalweges eine neue Strategie für die Behandlung von MASH darstellen.

Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) is the primary cause of liver-related illness and mortality caused by caloric excess and a sedentary lifestyle. MASLD encompasses a spectrum of chronic liver diseases that begins with hepatic steatosis and over time progresses to a more malignant form termed metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH), cirrhosis, and ultimately hepatocellular carcinoma. The progression from MASLD to MASH starts with the hepatic accumulation of lipids (steatosis) and is followed by the activation of several liver resident cells, including hepatic stellate cells (HSCs). Transition of HSCs from a ‘’quiescent’’ to an ‘’activated’’ phenotype is a key driver in the development of MASH. MASH is often associated with cardiovascular disease, which may have its origin in atherosclerosis. In addition to the risk factors that influence both atherosclerosis and MASH, it has been reported that the 3’,5’-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) pathway may have an impact on both diseases. The generation of the second messenger cGMP via nitric oxide (NO)-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) is central to regulating cardiovascular physiology. The significance of the NO/NO-GC/cGMP pathway is reflected by the successful clinical use of drugs that modulate this pathway to treat diseases like heart failure and pulmonary hypertension. Within the hepatic system, the NO/NO-GC/cGMP pathway has been described in HSCs. The pathogenesis of liver diseases like MASH is associated with the reduced bioavailability of NO and an increased oxidative stress. Oxidative stress can lead oxidation of NO-GC’s heme group, rendering the enzyme unresponsive to NO. In contrast to NO, the recently developed class of NO-GC activators can bind the oxidized heme-free NO-GC and can thereby potentially increase hepatic cGMP levels under disease conditions. The present study aimed to identify the role and pharmacological relevance of the NO/NO-GC/cGMP pathway in MASH, with a focus on HSCs. In particular, we explored whether a novel NO-GC activator tool compound from Bayer might affect the disease progression. To address these questions, a MASH/atherosclerosis comorbidity mouse model was established by feeding apolipoprotein E knockout mice a high-fat diet (HFD; hereafter referred to as HFD mice). The key features of MASH, including the activation of HSCs, were analysed in HFD and control mice using histological techniques. The expression of central components of the cGMP pathway (NO-GC and cGMP dependent protein kinase type I, cGKI) and HSC markers (desmin, α-SMA, and SM22) was analysed in liver tissue lysates and sections via western blot and immunofluorescence staining respectively. cGMP was visualized in real-time in primary murine HSCs using a Förster/fluorescence resonance energy transfer-based cGMP biosensor. Thereby, the spatiotemporal dynamics of cGMP signals in response to NO and a novel NO-GC activator were monitored in primary HSCs on day 2 and day 8 in culture. HFD mice were treated with the novel NO-GC activator (HFD supplemented with activator) to study its effect on MASH development. In addition to histology and immunofluorescence staining, the livers from activator treated mice were subjected to biochemical and RNA expression analysis. HFD mice successfully developed MASH together with its comorbidity atherosclerosis. They showed weight gain and hepatomegaly together with the full spectrum of characteristics of MASH, including steatosis, ballooning, inflammation, and fibrosis as opposed to control mice. The development of fibrosis was associated with the activation of HSCs within the MASH livers marked by their expansion and increased expression of -SMA and SM22. NO-GC and cGKI exhibited robust expression in HSCs independent of their activation state. In line with our in vivo findings, both day 2 and day 8 HSCs in culture showed cGMP generation in response to NO or the NO-GC activator. Most strikingly, treatment of HFD mice with the NO-GC activator improved the MASH phenotype as reflected by reduced hepatocyte ballooning and hepatic fibrosis, and a trend towards reduced liver enzyme levels (AST and ALT) and inflammation markers analysed via histochemistry (Mac-2 and F4/80) and RT-PCR (TNFa, IL6, IL1A, IFNG, CCL2, and CXCL10). Taken together, these results imply that a functional NO/NO-GC/cGMP signalling pathway exists in HSCs in the liver and its components NO-GC and cGKI can be proposed as markers for HSCs. Importantly, the pharmacological activation of this pathway might provide a new strategy for the treatment of MASH.