Einfluss des Entwicklungsstadiums und des Wnt-Signalwegs auf die Neurogenese von Progenitoren des enterischen Nervensystems in vitro

Abstract

Das enterische Nervensystem (ENS) besteht aus einem weitgehend autonomen Netzwerk von neuronalen und glialen Zellen innerhalb der Wand des Verdauungssystems. ENS-Zellen stammen von Neuralleistenzellen ab, die während der Embryogenese in den Gastrointestinaltrakt einwandern. Eine Subpopulation dieser Neuralleistenzellabkömmlinge weisen auch noch im postnatalen Entwicklungsstadium Stammzelleigenschaften auf. Dies ermöglicht es, neurale Progenitoren aus der Darmwand zu isolieren, welche mit Hilfe von definierten Zellkulturverfahren in sogenannten Enterosphärenkulturen proliferiert und nachfolgend differenziert werden können. Dabei besitzen die in vitro-expandierten ENS-Progenitoren einer Enterosphäre die multipotente Fähigkeit, sich in verschiedene neuronale Subtypen und Gliazellen zu differenzieren. Unter Verwendung dieser Zellkulturtechniken wurden im Rahmen der Promotionsarbeit zwei Hauptziele verfolgt: Zum einen sollte das Proliferations- und Differenzierungspotential von ENS-Progenitoren vergleichend zwischen dem spätfötalen und neonatalen Entwicklungsstadium der Maus bestimmt werden. Zum anderen wurde der Einfluss des Wnt-Signalwegs auf die Neurogenese von neonatalen murinen ENS-Vorläuferzellen in vitro untersucht. Für die Bearbeitung der Fragestellungen wurden verschiedene Zellkulturverfahren, BrdU-Markierungsmethoden und Immunfluoreszenztechniken zur Detektion und Auswertung der intestinalen Zellen angewandt. Im Rahmen eines Kooperationsprojekts konnte in der Promotionsarbeit mit Hilfe von BrdU-Komarkierungstechniken definitiv bewiesen werden, dass elektrophysiologisch abgeleitete funktionale Neurone der Maus sich aus proliferierenden ENS-Progenitoren und nicht ausschließlich aus determinierten nicht mehr teilenden Nervenzellen in der Zellkultur entwickelten. Zudem zeigten die Experimente zum entwicklungsabhängigen Wachstumsverhalten, dass ENS-Progenitoren aus spätfötalen E18-Mäusen ein deutlich höheres proliferatives Potential in der Zellkultur gegenüber neonatalen ENS-Zellen aufwiesen. Die Untersuchungen zum Einfluss des Wnt-Signalwegs ergaben, dass die in der Proliferationsphase applizierten Substanzen R Spondin1, SB216763 und Wnt3a, von denen bekannt ist, dass sie den kanonischen Wnt-Signalweg stimulieren bzw. verstärken, sowohl das Wachstum der Enterosphären als auch die Neurogenese der neonatalen ENS-Progenitoren förderten. Demgegenüber steigerte der Wnt-Antagonist DKK1 zwar das Enterosphärenwachstum, er zeigte jedoch keinen Effekt auf die Neubildung von Neuronen. Von besonderem Interesse ist die Beobachtung, dass eine Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs die Proliferation der kultivierten ENS-Progenitoren auch bei einer geringen Zellanzahl induzierte und aufrechterhielt. Dies könnte besonders für Implantationsexperimente und zukünftige Zelltherapien von Bedeutung sein, wenn nur wenig Biopsiematerial für Zellexpansionsverfahren zur Verfügung steht. Die Erkenntnisse aus der Promotionsarbeit bildeten neue Ausgangspunkte für weitergehende molekular- und zellbiologische Untersuchungen zur Charakterisierung des Wnt-Systems sowohl bei murinen als auch humanen postnatalen ENS-Progenitoren in vitro. In zukünftigen Studien wäre es interessant zu evaluieren, inwieweit durch die unterschiedlichen Wnt-Signalkaskaden neben der Zellproliferation weitere zelluläre Prozesse wie die Zellmigration oder die Zelldifferenzierung im postnatalen ENS reguliert werden. Ebenso ist es aus wissenschaftlicher Sicht spannend, Wechselwirkungen der ENS-Zellen mit nicht-neuralen Zellen des Darms tiefergehend zu analysieren, die möglicherweise über verschiedene Wnt-Signalwege vermittelt werden.