Phylogeny, pangenomics, and predicted functional diversity of maize rhizosphere Pseudomonas

Abstract

Wie alle mehrzelligen Organismen auf diesem Planeten, sind Pflanzen Holobionten. Meistens sind ihre unterirdischen Gewebe im Boden, ein mikrobenreicher Lebensraum bereits an sich, verankert. Aus diesem immensen Reservoir mikrobieller Vielfalt erwirbt die Pflanze eine wesentliche Gemeinschaft von Bakterien, Archaeen, Pilzen und mikroskopischen Eukaryoten, die ihr Wurzelmikrobiom, auch Rhizosphäre genannt, bilden. Diese Form der Lebensgemeinschaft existiert bereits seit Hunderten von Millionen Jahren; sie umfasst ein komplexes Nahrungsnetz mit dem Wirt als Nährstoffquelle und den Mikroben als Konkurrenten um Ressourcen und Vermittler zwischen dem Wirt und der Umwelt. Die wesentlichen Interaktionen werden häufig durch abiotische Faktoren wie Feuchtigkeit, Temperatur, pH-Wert und die Verfügbarkeit anorganischer Mineralien beeinflusst. Diese Symbioseformen reichen von Mutualismus bis Parasitismus, wobei die überwiegende Mehrheit der Mikrobenarten in einer kommensalen Beziehung mit der Pflanze lebt. Um den genetischen Mechanismus der Auswahl bestimmter Bakterientaxa durch die Pflanze näher zu untersuchen, wurde eine Studie wurde eine Studie durchgeführt, um ein Profil dieser Gemeinschaften in Mais zu erstellen und festzustellen, welche Gattungen oder Arten von Bakterien vererbbar zu sein scheinen. Anhand der 16s rRNA Sequenzierung mehrerer tausend Maisrhizosphären zeigte sich, dass einige Taxa vererbbar zu sein schienen, interessanterweise gab es eine auffällige zeitlich begrenzte Zunahme der Gattung Pseudomonas-Abundanz in fast allen Proben. Bei diesm Phänomen handelte es sich weder um eine Kontamination der Proben noch um Sequenzierungsartefakte. Diese Abundanz konnte auf der Gattungsebene der Mikroben nicht mit ihrer Phylogenie oder ihrerer Funktionen in Verbindung gebracht werden, da Pseudomonas äußerst divers und artenreich ist, wobei die Arten von Nützlingen bis Pathogenen reichen. Die Ziele dieser Arbeit umfasst die Identifizierung die Arten dieser blühenden Pseudomonas, die Ermittlung ihrer phylogenetischen Verwandtschaft und die Durchführung von In-silico-Vorhersagen ihres funktionellen Potenzials auf der Grundlage ihres jeweiligen Geninhalts. Darüber hinaus soll mittels metagenomischer Sequenzierung die Genome der Rhizosphären-endemischen Pseudomonas-Stämme zusammengesetzt werden und andere Phyla zu charackterisieren, die in dieser Umgebung vorkommen und von denen bekannt ist, dass sie mit Pseudomonas interagieren. Durch die Shotgun-Sequenzierung des Metagenomes jeder Rhizosphäre wurde eine Auflösung auf Artniveau für alle bakteriellen und eukaryotischen Taxa erreicht. Dabei zeigte sich, dass die Pseudomonas-Population tatsächlich aus 394 verschiedenen Arten mit einem hohen Grad an phylogenetischer Verwandtschaft bestand. Die am häufigsten vorkommenden Arten waren P. brassicacearum, P. frederiksbergensis E und P. silesiensis, wobei der Anteil der einzelnen Arten je nach Feld erheblich variierte. Ein Schwellenwert für die relative Häufigkeit von Pseudomonas wurde für die biologische Relevanz festgelegt, und aus repräsentativen Genomen jeder Art wurde eine Phylogenie auf der Grundlage von Kerngenen mit einer einfachen Kopie erstellt. Auf diese Weise wurden monophyletische Gruppen und Untergruppen identifiziert, benannt auf Grundlage Literatur beschriebener Stämme. Kategorisiert wurden diese Gruppen als Fluorescens-Linie oder Nicht-Fluorescens-Linie, wobei erstere die Rhizosphäre sowohl in Bezug auf die Anzahl der Arten als auch deren kombinierte relative Häufigkeit dominierte. Eine Pan-Genomanalyse dieser Pseudomonas-Arten ergab, dass phylogenetische Gruppenzugehörigkeit auf der Grundlage ganzer Genome mittels Beta-Diversitätsmetriken, wie die Bray-Curtis-Dissimilarität, unterschieden werden können. Phänotypische Vorhersagen deuten darauf hin, dass Gruppen der Fluorescens-Linie gewisse Kohlenhydrate wie Arabinose, Trehalose und Maltose bevorzugt verwerten, während häufig vorkommende Arten dieser Linie offenbar vermehrt Gene für die Stickstoffreduktion aufweisen. Der Gehalt an Metall- und antimikrobiellen Resistenzgenen war über alle phylogenetischen Gruppen hinweg konserviert, wohingegen der Gehalt an Virulenzgenen den größten Unterschied zwischen beiden Linien und Untergruppen ausmachte. Im Gegensatz zum Resistom war der Gehalt an Sekundärstoffwechsel-/Biosynthese-Geneclustern bei den einzelnen Arten sehr unterschiedlich, wobei die überwiegende Mehrheit dieser Gencluster in weniger als zehn Genomen vorkam. Bei der geringen Anzahl, die zwischen den Gruppen übereinstimmte, handelte es sich größtenteils um Beta-Lakton-Antibiotika und Bakteriozine. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Kern- als auch akzessorische Gene zur Unterscheidung zwischen Pseudomonas der Fluorescens-Linie unabhängig von der Taxonomie verwendet werden können. Das Resistom ist zwischen den Gruppen sehr konserviert, wobei die Sekundärmetaboliten weitgehend einzigartig für die einzelnen Arten sind. Dies lässt vermuten, dass Pseudomonas in der Rhizosphäre unter dem Druck stehen, eine konsistente Abwehr aufrechtzuerhalten, die spezifische Antibiotika- und Multidrug-Efflux-Operons umfasst, während sie gleichzeitig neue offensive Sekundärmetaboliten entwickeln oder erwerben, um die Wettbewerbsfähigkeit zwischen eng verwandten Arten zu erhalten.

Plants, like all multicellular organisms on this planet, exist as a holobiont. Their underground tissues are often anchored in soil, which in itself is a very microbe-rich habitat. From this vast reservoir of microbial diversity the plant acquires an essential community of bacteria, archaea, fungi, and microscopic eukaryotes that comprises their root microbiome, or rhizosphere. This relationship has existed for hundreds of millions of years; it involves a complex food web with the host as a source of nutrients and the microbes as both competitors for resources and intermediaries between the host and the environment. Essential interactions are often modulated by abiotic factors such as moisture, temperature, pH, and inorganic mineral availability. The symbioses formed run the gamut from mutualistic to parasitic, with the vast majority of microbial species existing in a commensal relationship with the plant. To better understand the genetic mechanism by which the plant selects for certain bacterial taxa a study was conducted to profile these communities in maize, and to determine which genera or species of bacteria appeared to be heritable. 16S rRNA sequencing of several thousand maize rhizospheres revealed a possible heritability of some taxa and a striking period of increased abundance of the genera Pseudomonas. This phenomena could not be explained as contamination or as a sequencing artifact. At genus level it was impossible to relate phylogeny or function to this abundance phenotype due to Pseudomonas being highly diverse and containing thousands of individual species, which range from beneficial to pathogenic. The aims of this work are first to identify these blooming Pseudomonas at species level, next to ascertain their phylogenetic relationships, then to perform in silico predictions based on gene content to infer the functional potential of these taxa. Furthermore, to use metagenomic sequencing to assemble the genomes of the Pseudomonas strains endemic to these rhizospheres, as well as profile other phyla that are present within this environment and are known to interact with Pseudomonas. By whole-genome shotgun sequencing of each rhizosphere, species level resolution was achieved for all bacterial and eukaryotic taxa. This revealed the Pseudomonas population consisted of 394 species with a high degree of phylogenetic relatedness. The most abundant of these were P. brassicacearum, P. frederiksbergensis E, and P. silesiensis, with the proportions of each varying significantly by field. A threshold for biological relevance in Pseudomonas relative abundance was set and representative genomes for each species were used to construct a phylogeny based on single copy core genes. With this, monophyletic groups were identified along with subgroups named based on literature type strains. These groups were categorized as belonging to either the fluorescens lineage or non-fluorescens lineage, with the former dominating the rhizosphere in both number of species and their combined relative abundance. A pan-genome analysis of these Pseudomonas species revealed that beta diversity metrics such as Bray-Curtis dissimilarity can distinguish phylogenetic group membership based on whole genomes. Phenotype predictions indicated that fluorescens lineage groups are more likely to utilize certain carbohydrates such as arabinose, trehalose, and maltose, while high abundance species of this lineage appear to be enriched in genes related to nitrogen reduction. Antimicrobial and metal resistance gene content appears to be highly conserved across all phylogenetic groups, with virulence gene content being the most discriminatory between both groups and subgroups. Unlike the resistome, secondary metabolite/biosynthetic gene cluster content was highly unique between individual species, with the vast majority of these gene clusters appearing in fewer than ten genomes. The scant number that were consistent between groups were largely β-lactone antibiotics and bacteriocins. These results indicate both core and accessory genes can be utilized in discriminating between fluorescens lineage Pseudomonas independent of taxonomy. The resistome is highly conserved between groups but secondary metabolites are largely unique to individual species. This suggests rhizosphere Pseudomonas may be under pressure to maintain consistent defenses involving specific antibiotic and multidrug efflux operons, while concurrently evolving or acquiring novel offensive secondary metabolites to maintain competitiveness between closely related species.