Lokales Gen-Silencing durch siRNA-haltige Beschichtungen in Ea.hy926

Abstract

Das primäre Ziel der in der o.g. Dissertation dargestellten Versuche war, eine effektive Beschichtung zu etablieren, über die ein lokales „Gen-Silencing“ des für ICAM-1 codierenden Gens über mehrere Tage vermittelt werden kann. Im klinischen Zusammenhang soll diese Beschichtung als Prototyp für eine koronararterielle Stent-Beschichtung gesehen werden, mit der letzlich die Leukodiapedese lokal unterbunden wird. Hierdurch könnte gewinnbringend in den pathophysiologischen Mechanismus der Restenose eingegriffen werden. Die experimentellen Beschichtungen basierten zum Teil auf Atelokollagen als Trägermolekül. Für Atelkollagen ist in der Literatur ein transfektionsfördernder Effekt beschrieben. Es erfolgte die Zugabe von siRNA, sowie Lipofectamine als Transfektionsmittel. Auf den Beschichtungen wurde die hybridisierte Zelllinie Ea.hy926 kultiviert, die gemeinhin als vaskuläres Zellmodel verwendet wird. Die in der Dissertation dargestellten Versuchsreihen beschäftigen sich mit dem Transfektionserfolg auf unterschiedlichen Beschichtungen, der Freisetzung von siRNA aus den Beschichtungen, dem nachweislichen „Knockdown“ des für ICAM-1 codierenden Gens, sowie der Hämokompatibilität der Beschichtungen. Zunächst ergaben sich auffällige Diskrepanzen die Transfektionseffizienz betreffend: So konnte der in der Literatur bestätigte transfektionsfördernde Effekt des Atelokollagenmoleküls in unseren Versuchen nur in einem deutlich geringeren Ausmaß nachgewiesen werden [82]. Über die Integration des biologischen Transfektionsmittels Lipofectamine in die Beschichtungen konnten aber im weiteren Verlauf deutlich höhere Transfektionserfolge erzielt werden. Interessanterweise ergab sich auch ein deutlicher Unterschied zwischen den optimalen Atelokollagen-Mengen für Transfektion und Knockdown: Höhere Atelokollagen-Mengen erwiesen sich als förderlich für die Transfektionseffizienz, aber gleichzeitig auch als nachteilig für längerfristige Knockdown-Effekte. Die Versuche zur Freisetzungskinetik der siRNA zeigten für alle Beschichtungen einen schlagartigen „Burst-Release“. Dieser Burst-Release scheint mit dem erfolgreichen ICAM–1–Knockdown zu korrelieren, der nach 48 Stunden sowohl für niedrige als auch für hohe Atelokollagen-Konzentrationen nachweisbar war. Über 9 Tage hinweg zeigte sich eine länger anhaltende siRNA-Freisetzung auf Beschichtungen mit höherer Atelokollagenkonzentration. Dieser zunächst als positiv wahrgenommene Effekt erwies sich in den Knockdown-Versuchen als irrelevant: Auf Beschichtungen mit einer 0,008%igen Atelokollagenkonzentration konnte ein zur Kontrolle signifikanter Knockdown 4 Tage länger aufrechterhalten werden, als auf Beschichtungen mit 0,032%iger Atelokollagenkonzentration. Eine über mehrere Tage anhaltende, geringere siRNA-Freisetzung nach anfänglichem „Burst-Release“ scheint das Gen-Silencing auf Ea.hy926 daher im Rahmen der hier untersuchten Zeiträume nicht positiv zu beeinflussen. Möglicherweise könnte eine Kombination aus beiden Atelokollagenbeschichtungen sowohl kurzfristig als auch langfristig eine Verbesserung des Knockdowns ermöglichen. Neben der Effizienz des Gen-Silencings stand die Biokompatibilität der Beschichtung im Vordergrund. Dabei wurden sowohl die Viabilität der Zellen auf der Beschichtung (Zytotoxizitätstest), als auch die Hämokompatibilität mit menschlichem Blut getestet. Die Atelokollagen-Beschichtungen erwiesen sich zu Humanblut kompatibel, ohne signifikante Hämolyse oder einen Abfall der Erythrozyten-, Leukozyten und Thrombozytenzahl. Weiterhin zeigten sich auf Atelokollagenbeschichtungen niedrigerer Konzentration (0,008 % - 0,032 %) eine sehr gute Proliferation und Ausbreitung der Ea.hy926–Zellen. Die Beschichtungen sind daher vorerst als biokompatibel zu werten. Es sind jedoch nach DIN EN ISO 10993-1 weitere Tests erforderlich um die Biokompatibilität zu bestätigen. Die Gesamtheit der vorgestellten Ergebnisse zeigt, dass die etablierten Beschichtungen auf Atelokollagen-Basis ein effizientes Gen-Silencing vermitteln können, ohne dabei einen Kompromiss in Sachen Verträglichkeit einzugehen.