Electrospinning of biomimetic scaffolds: Why electrospun natural extracellular matrix components need not be the first material of choice

Abstract

Die zunehmende Zahl altersbedingter Krankheiten hat zu einer ungekannten Nachfrage nach Lösungen für den Organersatz geführt. Es mangelt an geeignetem Transplantationsmaterial, was den Bedarf an Behandlungen, die nicht auf Organtransplantationen beruhen, weiter erhöht. Im Bereich der regenerativen Medizin hat das Elektrospinnverfahren einen raschen Aufschwung erlebt, da es poröse Gerüste erzeugen kann, die die natürliche extrazelluläre Matrix (ECM) nachbilden. Neben synthetischen Polymeren ermöglicht die Technik auch die Verarbeitung natürlicher ECM-Proteine und ist somit ein erster Schritt auf dem Weg zum De-novo-Engineering voll funktionsfähiger, faseriger Gewebe. Obwohl bereits eine Vielzahl von Materialien zu faserartigen Scaffolds elektrogesponnen wurde, bleibt die Frage, ob synthetische Polymere oder natürliche ECM-Proteine als primäres Scaffold-Material verwendet werden sollten, weiterhin umstritten.

Verlockend ist vor allem die Verwendung von Kollagen, dem Hauptbestandteil der ECM in Bindegeweben, das jedoch während des Elektrospinnprozesses denaturiert - es entsteht ein Produkt, das biochemisch betrachtet nicht mehr dem natürlichen Kollagen entspricht. Zwar wurde lange Zeit der Verdacht geäußert, dass die Verwendung fluorierter Lösemittel dafür verantwortlich ist, doch in dieser Arbeit wird gezeigt, dass diese Denaturierung möglicherweise unabhängig von der Wahl des Elektrospinn-Lösungsmittels auftritt. Eine Mischung aus Essigsäure und Ethanol führte ebenfalls zu einer ungeordneten und entfalteten Tripelhelix in elektrogesponnenem Kollagen, was durch eine Kombination aus Zirkulardichroismus, Raman-Spektroskopie, Multiphotonenmikroskopie und enzymatischen Verdauungsversuchen bestätigt wurde. Die Zell-Material-Interaktionsstudien haben die entstandenen Schäden auf molekularer Ebene nicht aufgedeckt, die jedoch in der Literatur häufig als Indikator für die Biokompatibilität angesehen werden.

Thermoplastische Polyurethane haben seit langem eine ausgezeichnete Reputation als relativ inerte Materialien mit hervorragender Biokompatibilität. Die Synthese von Polyurethanen erfordert jedoch immer noch häufig die Verwendung gefährlicher und giftiger Isocyanate, was angesichts der aufkommenden grünen Chemie ein zunehmend schwer vertretbarer Syntheseweg wird. Zweitens werden für das Elektrospinnen von Polyurethan häufig Lösemittel benötigt, die ein Gesundheitsrisiko für den Anwender darstellen. Hier haben wir elektrogesponnenes, hochmolekulares Polycarbonat auf Basis von Nicht-Isocyanat-Polyurethan vorgestellt, das als biokompatibles poröses Trägersubstrat verwendet werden kann und eine Anwendung im kardiovaskulären Tissue Engineering ermöglicht. Die elektrogesponnenen NIPUs wiesen, auch ohne Kollagenbeschichtung, eine hervorragende Biokompatibilität auf, die mit der von elektrogesponnenen Kollagenfasermatten vergleichbar war.

Dies bedeutet nicht unbedingt, dass die Verwendung natürlicher ECM-Komponenten und Adhäsionsproteine in elektrogesponnenen Scaffolds gar keine Berechtigung mehr hat. Diese Proteine können durchaus eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Regeneration von elektrogesponnenen Implantaten spielen. So haben wir beispielsweise ein elektrogesponnenes Gefäßimplantat, das mit Decorin und Fibronektin beschichtet war, in einem modularen Bioreaktorsystem unter dynamischen Flussbedingungen untersucht und festgestellt, dass die Endothelialisierung von einer solchen Biofunktionalisierung profitieren könnte. Diese Erkenntnisse deuten aber eher darauf hin, dass der Einsatz biokompatibler, synthetischer Materialien, wie z.B. Polyurethane, in elektrogesponnenen Implantaten als primäres Material eine strategischere Wahl darstellen könnte. Gegebenenfalls könnte der Regenerationsprozess jedoch durch die Einbindung natürlicher Komponenten verbessert werden. Es wurde auch gezeigt, dass es notwendig sein könnte, physiologische Bedingungen umfassender zu simulieren, um die zusätzlichen Vorteile der Einbeziehung von natürlichen Proteinen zu ermitteln.

The increasing prevalence of age-related diseases has created an unprecedented demand for organ replacement solutions. Adequate transplant material is scarce, fuelling the need for treatments that do not rely on organ transplantation. Electrospinning has seen a rapid emergence in the field of regenerative medicine, for its ability to create porous scaffolds that mimick the native extracellular matrix (ECM). In addition to synthetic polymers, the technique also allows the processing of natural ECM proteins, essentially paving the way for de novo engineering of fully functional fibrous tissues. Although a wide range of materials has been electrospun into fibrous scaffolds, the question of whether synthetic polymers or natural ECM proteins should be used as the primary scaffold material remains an ongoing debate.

The use of collagen is tempting as it is the major constituent of the ECM in connective tissues, yet gets denaturated during the electrospinning processes and yields a product, which does not biochemically represent native collagen anymore. Although fluorinated solvents have long been suspected as the culprit, the work in this thesis provides evidence that this denaturation might occur irrespective of the choice of electrospinning solvent. A mixture of acetic acid and ethanol also left electrospun collagen with a disordered and unravelled triple helix, as was confirmed by a combination of circular dichroism, Raman spectroscopy, multiphoton microscopy, and enzymatic digestion. In vitro cell-material interaction studies did not uncover the inflicted damage, which has often been used in the literature as an indicator of biocompatibility.

Thermoplastic polyurethanes have a long standing reputation as relatively inert materials with outstanding biocompatibility. The synthesis of polyurethanes, however, still often necessitates the use of hazardous and toxic isocyanates, which becomes an increasingly unviable synthesis route in the light of the emerging green chemistry. Secondly, the electrospinning of polyurethane often requires solvents that pose health risks towards the operator. Here, we presented electrospun high molecular weight non-isocyanate polycarbonate-based polyurethane for use as biocompatible porous scaffolds and with potential application in cardiovascular tissue engineering. The electrospun NIPUs had excellent biocompatibility, even without a collagen coating, which matched that of the electrospun collagen mats.

This does not necessarily imply that the use of natural ECM components and adhesion proteins in electrospuns is no longer justified. These proteins can indeed perform a pivotal role in facilitating the in situ regeneration of implanted electrospun grafts. For instance, we evaluated an electrospun vascular graft that was coated with decorin and fibronectin within a modular bioreactor system under dynamic flow conditions and found that endothelialisation might benefit from such biofunctionalisation. These findings rather suggest that biocompatible synthetic materials, such as polyurethanes, could serve as a more strategic choice for the primary material in electrospun grafts. However, where appropriate, the regenerative process could be enhanced by the incorporation of natural components. It was also shown, that it may be necessary to simulate physiological conditions more comprehensively in order to determine the additional benefits of incorporating natural proteins.

De toenemende prevalentie van leeftijdsgerelateerde ziekten heeft een ongekende vraag naar oplossingen voor orgaanvervanging gecreëerd. Geschikt transplantatiemateriaal is schaars, waardoor de behoefte aan behandelingen die niet afhankelijk zijn van orgaantransplantatie, toeneemt. Elektrospinning heeft een snelle opkomst op het gebied van regeneratieve geneeskunde doorgemaakt, aangezien het in staat is poreuze scaffolds te maken die de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) nabootsen. Naast synthetische polymeren is het met deze techniek ook mogelijk om natuurlijke ECM-eiwitten te verwerken, wat in wezen de weg vrijmaakt voor de de novo-ontwikkeling van volledig functioneel vezelachtig weefsel. Hoewel een breed scala aan materialen tot vezelachtige scaffolds is elektrogesponnen, blijft de vraag of synthetische polymeren of natuurlijke ECM-eiwitten als het primaire scaffoldmateriaal moeten worden gebruikt een voortdurende discussie.

Het gebruik van collageen is aantrekkelijk, omdat het het hoofdbestanddeel van de ECM in bindweefsel is, maar het wordt tijdens het elektrospinnen gedenatureerd -- het levert een product op dat biochemisch gezien niet meer overeenkomt met natuurlijk collageen. Fluorhoudende oplosmiddelen werden lange tijd verdacht als de boosdoener, maar het werk in dit proefschrift levert het bewijs dat deze denaturatie ongeacht de keuze van het elektrospinoplosmiddel kan optreden. Een mengsel van azijnzuur en ethanol liet ook elektrogesponnen collageen met een ongeordende en ontvouwde drievoudige helix achter, hetgeen werd bevestigd door een combinatie van circulair dichroïsme, Raman spectroscopie, multifotonmicroscopie en enzymatische afbraak. In vitro onderzoek naar cel-materiaalinteracties kon de toegebrachte schade niet aan het licht brengen, wat echter in de literatuur vaak als aanwijzing voor de biocompatibiliteit is gebruikt.

Thermoplastische polyurethanen hebben een lang gevestigde reputatie als relatief inerte materialen met een uitstekende biocompatibiliteit. Voor de synthese van polyurethanen is echter nog steeds vaak het gebruik van gevaarlijke en giftige isocyanaten nodig, wat in het kader van de opkomst van milieuvriendelijke chemie een steeds minder levensvatbare syntheseroute wordt. Ten tweede zijn voor het elektrospinnen van polyurethaan vaak oplosmiddelen nodig die gezondheidsrisico's voor de gebruiker met zich meebrengen. In dit werk toonden we een elektrogesponnen niet-isocyanaat-polyurethaan (NIPU) op basis van polycarbonaat met een hoog molecuulgewicht voor gebruikt als biocompatibele poreuze scaffolds met potentiële toepassing in de cardiovasculaire tissue engineering. De elektrogesponnene NIPU's hadden ook zonder collageencoating een uitstekende biocompatibiliteit, die overeenkwam met de elektrogesponnene collageenscaffolds.

Dit hoeft niet te betekenen dat het gebruik van natuurlijke ECM-componenten en hechtingseiwitten in elektrogesponnene scaffolds in zijn geheel niet meer nodig is. Deze eiwitten kunnen wel degelijk een cruciale rol spelen bij het faciliteren van de in situ-regeneratie van geïmplanteerde elektrogesponnene transplantaten. We evalueerden bijvoorbeeld een elektrogesponnen bloedvatimplantaat dat gecoat was met decorine en fibronectine, in een modulair bioreactorsysteem onder dynamische stromingsomstandigheden en ontdekten dat endotheelvorming mogelijk baat heeft bij een dergelijke biofunctionalisatie. Dit bewijs suggereert echter wel, dat het gebruik van synthetische materialen, zoals polyurethanen, als het primaire materiaal in elektrogesponnene transplantaten een strategischere keuze kan zijn. Waar nodig zou het regeneratieve proces echter verbeterd kunnen worden door de toevoeging van natuurlijke componenten. Er werd ook aangetoond dat het nodig kan zijn om fysiologische omstandigheden uitgebreider te simuleren om de extra voordelen van het gebruik van natuurlijke eiwitten vast te stellen.