Entwicklung eines quantitativen Lateral-Flow-Tests für Amitriptylin

Abstract

In dieser Arbeit wurde ein quantitativer Lateral-Flow-Test für das Antidepressivum Amitriptylin entwickelt. Der Fokus der Teststreifenentwicklung lag auf dem Erkennungselement als wichtigstem Bestandteil eines Lateral-Flow-Tests. Um einen geeigneten Antikörper zu finden, wurden drei Antikörper gegen Amitriptylin in einer biomolekularen Interaktionsanalyse charakterisiert. Zur Auswertung der hierzu notwendigen Experimente wurden verschiedene mathematische Ansätze anhand von simulierten Bindungskurven einer Kinetik pseudo-erster Ordnung auf ihre Eignung für die biomolekulare Interaktionsanalyse untersucht. Die erhaltenen Erkenntnisse wurden auf reale Messungen angewandt, wobei die Bindungskurven mit reflektometrischer Interferenzspektroskopie erfasst wurden. Nach der Identifizierung des Antikörpers mit höchster Affinität zu Amitriptylin wurden Methoden zur Anbindung des Antikörpers an Goldnanopartikel für die Verwendung in Lateral-Flow-Tests untersucht. Über sechs verschiedene Synthesewege hergestellte Konjugate wurden verglichen. Mittels UV/Vis-Spektroskopie wurde die Ausbeute der hergestellten Konjugate für jeden Syntheseweg bestimmt. Zusätzlich wurde mit dynamischer Lichtstreuung die Stabilität gegenüber Agglomeration bewertet. Für die Beurteilung, ob die synthetisierten Konjugate für Lateral-Flow-Tests geeignet sind, wurden Kalibrierkurven auf strukturierten Teststreifen aufgenommen. Parallele Kanäle auf den verwendeten Teststreifen ermöglichten mehrere Messungen auf einem Streifen. Die Konjugatsynthese, bei der sich der Antikörper nach UV-Aktivierung direkt an die Oberfläche anlagerte, war am besten geeignet, da das Konjugat vergleichsweise wenig Agglomeration aufwies und auf den Teststreifen reproduzierbare Ergebnisse mit niedriger minimal nachweisbarer Konzentration zeigte. Kalibrierkurven in mit Amitriptylin gespiketem Serum bestätigten, dass die Nachweisempfindlichkeit mit MDC = 2,2 μg/l ausreichend niedrig war, um Amitriptylin in Patientenproben zu quantifizieren. Dies erlaubt die Verwendung der Teststreifen für therapeutisches Drug Monitoring. Da bei den Immunoassays eine nicht-lineare Kalibrierfunktion vorlag, wurde ein neues Auswerteverfahren für das Aufstockverfahren für eine robuste Quantifizierung entwickelt. Die Anwendbarkeit des Auswerteverfahrens wurde durch Simulationen und Bestimmung von Testosteron in verschiedenen Matrices mit Messungen der reflektometrischen Interferenzspektroskopie bestätigt. Testosteron wurde als Analyt gewählt, da für den Testosteron-Nachweis ein etablierter Assay vorlag und dieser als Modellsystem fungieren kann. Die Ergebnisse bestätigen, dass das Aufstockverfahren auch in Immunoassays eingesetzt werden kann.

With the growing demand for therapeutic drug monitoring for good patient care, lateral flow assays add an important contribution to point-of-care testing. In this work, a quantitative lateral flow assay for the antidepressant amitriptyline was developed. The focus of the test strip development was on the recognition element as the most important component of the final lateral flow assay. Antibody gold nanoparticle conjugates were used for the specific recognition of the analyte. To find a high-affinity antibody, three antibodies against amitriptyline were characterised in a biomolecular interaction analysis. For the evaluation of the required kinetic experiments, various algorithms were examined assessing their suitabilty for biomolecular interaction analysis. These mathematical approaches were compared in-depth using simulated binding curves following pseudo-first order kinetics. The findings obtained were applied to real reflectometric interference spectroscopy measurements of anti-amitriptyline antibodies to analyse their kinetic and thermodynamic characteristics. After identification of the antibody with the highest affinity for amitriptyline, methods for conjugation of antibodies to gold nanoparticles were investigated. Conjugates prepared via six synthetic routes were compared. UV/Vis spectroscopy was used to determine the yield of the conjugates produced for each synthetic route. In addition, dynamic light scattering was used to assess their stability to agglomeration. To judge their performance on lateral flow assays, calibration curves were recorded on structured lateral flow assays. Parallel channels on the test strips allowed multiple measurements on one strip. The conjugate synthesis with direct coating after UV activation of the antibody was the most suitable as it showed comparatively little aggregation and reproducible results on the test strips. Calibration curves in serum spiked with amitriptyline showed that the minimum detectable concentration MDC = 2,2 μg/l was sufficient to quantify amitriptyline in patient samples. This allows the use of the test strips for therapeutic drug monitoring. Since immunoassays have non-linear calibration curves, an evaluation procedure using the standard addition method was developed to establish a robust quantitative readout for immunoassays. The applicability of the evaluation procedure was confirmed by simulations and quantification of testosterone in different matrices with reflectometric interference spectroscopy measurements. Testosterone was chosen as an example analyte as the testosterone assay is established and can act as a model system. The results confirm that the standard addition method can be transferred to immunoassays with nonlinear calibration curves.