Inhaltszusammenfassung:
Das Ziel dieser Dissertation war es, die humanen Haarfollikel (HF) und ersten auswachsenden Keratinozyten genauer zu charakterisieren. Dabei wurden verschiedene Parameter wie der Ort und die Zeit bis zum Auswachsen angeschaut sowie morphologische Veränderungen über die Zeit der Inkubation. Ziel war es weiterhin, die Zeitspanne bis zum ersten Erscheinen der Keratinozyten durch Zugabe von kleinen Molekülen zu reduzieren. Darüber hinaus wurden die HF und die an ihnen auswachsenden Keratinozyten in Zellkulturansätzen und Immunfluoreszenzfärbungen untersucht und charakterisiert. Zur Analyse der Haare und Keratinozyten auf RNA-Ebene wurde zusätzlich eine qRT-PCR durchgeführt.
Mit Hilfe dieser Ergebnisse erhofft man sich, die Gewinnung von induziert pluripotenten Stammzellen (iPSZ) aus gezupften HF zu beschleunigen, die Prozedur weniger anfällig zu gestalten und damit den gesamten Prozess zu vereinfachen. Die Gewinnung dieser iPSZ ist für die heutige Forschung insofern immens wichtig, dass durch sie die Modellierung von Krankheitsmodellen erforscht werden kann, ein besseres Verständnis der verschiedenen Krankheiten erreicht werden kann und auch die Erprobung verschiedenster Therapieansätze möglich ist.
Bei der von uns gewählten Methode werden humane HF extrahiert und kultiviert, um das Auswachsen von Keratinozyten an diesen zu provozieren. Diese können dann im weiteren Verlauf zu eben diesen iPSZ „reprogrammiert“ werden. Diese Methode stellt hierbei unter den bereits etablierten Verfahren zur Gewinnung der iPSZ (z.B. aus Hautbiopsien) ein minimalinvasives, beinahe schmerzfreies, einfach durchführbares und sehr praktikables Verfahren dar.
Im Rahmen dieser Dissertation konnte festgestellt werden, dass die extrahierten und kultivierten HF der anagenen Wachstumsphase eine deutliche morphologische Varianz untereinander aufwiesen, genauso wie die an ihnen auswachsenden Keratinozyten. Ebenfalls konnte analysiert und charakterisiert werden, dass die kultivierten HF während ihrer Inkubation eine deutliche Veränderung hinsichtlich ihrer Morphologie durchlaufen, die äußerer Wurzelscheide der HF wird in diesem Prozess dicker und unregelmäßiger hinsichtlich ihrer Form, was von uns im Rahmen dieser Dissertation erstmals genau beschrieben und quantifiziert wurde.
Die Zeit bis zum Auswachsen der ersten Keratinozyten wurde bereits in diversen Publikationen oberflächlich angeschnitten, durch unsere Forschung konnte eine spezifischere und genauere Analyse der Auswachszeitpunkte erreicht werden; zeitgleich konnte auch der Ort, an dem die ersten Keratinozyten an den HF auswuchsen, erstmals genauer erforscht und beschrieben werden.
Da eine schnelle Gewinnung und Kultivierung der an den HF auswachsenden Keratinozyten für die Forschung von großer Bedeutung ist, wurde untersucht, ob die Zeitdauer bis zum Auswachsen der ersten Keratinozyten durch Veränderung des Grundmediums beeinflusst werden kann. Es wurden Zusätze getestet, durch die in verschiedenste Signalwege eingegriffen werden konnte. Deren Ziel war es die Proliferation der Zelle zu erhöhen, wodurch eine schnelle Auswachsgeschwindigkeit und erhöhte Erfolgsquote hinsichtlich der Anzahl der auswachsenden Keratinozyten erreicht werden sollte. Unter den insgesamt fünf getesteten Zellkulturzusätzen stellte sich die Verwendung von DAPT (Notch-Inhibitor) als vielversprechendster Zusatz heraus, da bei dessen Verwendung in all unseren Versuchen ein Auswachsen der ersten Keratinozyten im Median nach bereits 24 h Inkubation beobachtet werden konnte. Die Erfolgsquote von DAPT lag darüber hinaus bei 79,2 %.
Für eine weitere genauere Charakterisierung und Untersuchung der HF und Keratinozyten auf Protein- und RNA-Ebene wurde die Expression verschiedenster Keratine in den HF und Keratinozyten untersucht. Die Keratin-Familie nimmt eine wichtige Rolle innerhalb der Epidermis (in welche die HF eingebettet sind) und auch in den Haaren selbst ein, daher sollten bestimmte Mitglieder dieser Protein-Familie genauer erforscht werden. Das primäre Ziel hierbei war es herauszufinden, aus welcher Schicht der HF die ersten Keratinozyten genau auswachsen und welche Keratine die HF und Keratinozyten exprimieren. Durch die Forschung innerhalb dieser Dissertation ergibt sich die Vermutung, dass die Keratinozyten aus der äußeren Wurzelscheide der HF auswachsen.
Folglich können die Ergebnisse aus dieser Dissertation für andere Forschende genutzt werden, um den Prozess der Gewinnung von Keratinozyten für die Reprogrammierung zu iPSZ zu beschleunigen und zu vereinfachen. Die generierten iPSZ können zur Erforschung verschiedenster Krankheiten, deren Modellierung und Therapie genutzt werden.
Des Weiteren können auch verschiedene Krankheiten, die HF selbst und direkt betreffend, durch die genaue Charakterisierung der HF und den an ihnen auswachsenden Keratinozyten durch die Grundlagen aus dieser Dissertation ggf. besser verstanden und erforscht werden.
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