Inhaltszusammenfassung:
Invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT-Zellen) gehören zu einer kleinen Untergruppe von T-Lymphozyten, die einen invarianten T-Zell-Rezeptor (TZR) exprimieren und robuste immunregulatorische und zytotoxische Funktionen aufweisen. Zudem werden iNKT-Zellen mit einer niedrigeren Inzidenz der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (graft-versus-host disease, GvHD) assoziiert, die für die Erfolgsaussichten nach einer allogenen Stammzelltransplantation (allo-SZT) bedeutsam ist. In Mausmodellen wurde gezeigt, dass iNKT-Zellen durch die Expansion von regulatorischen T-Zellen (Treg) inhibitorische Effekte gegenüber alloreaktiven T-Zellen ausüben. Das Ziel dieser Arbeit war, den Mechanismus, durch den humane iNKT-Zellen immunologische Toleranz verursachen, in einem in vitro System zu untersuchen. Des Weiteren wird das Potential genetisch modifizierter iNKT-Zellen als Immuntherapeutikum alleine oder in Kombination mit PD-1-Checkpoint-Inhibition zur Verbesserung der Funktionalität dieser Zellen analysiert. Humane ex vivo expandierte iNKT-Zellen wurden im Rahmen von gemischten Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reactions, MLR) untersucht, wobei die T-Zell-Aktivierung und -Proliferation durch künstliche Antigen-präsentierenden Zellen (artificial antigen presenting cells, aAPCs) oder dendritische Zellen (dendritic cells, DC) stimuliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass T-Zell-Aktivierung und -Proliferation nur durch iNKT-Zellen gehemmt werden, wenn T-Zellen durch DCs und nicht durch aAPCs stimuliert werden. Ferner zeigten Transwell-Untersuchungen, dass dieser Effekt in einer Zell-Kontakt-abhängigen Weise stattfindet. Untersuchungen mit Blut-DCs von gesunden Spendern und Patienten deckten die präferentielle Apoptose von konventionellen DCs (conventional dendritic cells, cDCs) durch iNKT-Zellen auf, die interessanterweise die höchste CD1d-Expression aufweisen und wichtige T-Zell-Stimulatoren sind. Weiterhin wurden iNKT-Zellen genetisch modifiziert, um einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen das CD19-Antigen zu exprimieren. Diese Zellen zeigten robuste Zytotoxizität gegen CD19+ Zelllinien und Patienten-Blasten. Zudem behielten CD19-CAR-iNKT-Zellen ihre CD1d-Abhängigkeit und konnten sowohl über CD19 als auch CD1d zytotoxisch wirken. Obwohl PD-1-Checkpoint Inhibition keine Auswirkung auf die kurzfristige Zytotoxizität von CD19-CAR-iNKT-Zellen hatte, wurden signifikant erhöhte Mengen von Zytokinen und eine verbesserte Proliferation von Nivolumab-behandelten CD19-CAR-iNKT-Zellen festgestellt. Des Weiteren konnte sowohl die zytotoxische Wirkung als auch Zytokin-Freisetzung nach drei Stimulationsrunden mithilfe von Checkpoint-Inhibition partiell verbessert werden. Auch unter Checkpoint-Inhibition behielten CD19-CAR-iNKT-Zellen ihre inhibitorischen Eigenschaften und konnten die T-Zell-Aktivierung und -Proliferation weiter effizient verhindern. Diese Ergebnisse weisen auf das Potential von iNKT- und CD19-CAR-iNKT-Zellen im Rahmen der immunologischen Toleranz und für die Tumorkontrolle hin. iNKT-Zellen sind in der Lage allogene Immunreaktionen zu verhindern, während sie durch genetische Modifikation Krebszellen effizient beseitigen. Ferner konnte Checkpoint-Inhibition ihre Funktion verbessern, ohne das GvHD-Risiko zu erhöhen. Diese Daten weisen darauf hin, dass iNKT-Zellen ein ideales Immuntherapeutikum darstellen, welches seine Anwendung bei Rezidiven nach allo-SZT finden könnte.
Abstract:
Invariant natural killer (iNKT) cells are a small T-cell subset that express an invariant T-cell receptor (TCR) and show potent immunoregulatory and cytolytic properties. Importantly, iNKT cells have been associated with a decreased incidence of graft-versus-host disease (GvHD), which represents an important cause of therapy failure after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). In murine models, iNKT cells modulate immune tolerance through the expansion of regulatory T cells (Treg). Here, the first goal of this work was to identify the mechanism used by human iNKT cells to prevent GvHD using a human in vitro setting. Further, a comprehensive analysis of the potential of CD19-CAR-iNKT cells as an off-the-shelf immunotherapeutic strategy alone and in combination with the PD-1 inhibitor nivolumab to further increase functionality was performed. Human ex vivo expanded third-party iNKT cells were analyzed in the context of mixed lymphocyte reactions (MLR) using artificial antigen presenting cells (aAPCs) and/or dendritic cells (DCs) as stimulators and T cells in an allogeneic setting. T-cell activation and proliferation was only decreased by iNKT cells in MLR with DCs used as stimulators instead of aAPCs. Further, transwell assays demonstrated that this effect happens in a cell contact dependent manner. Analyses using blood DCs of healthy donors and patients revealed that iNKT cells induce preferential apoptosis of conventional DCs (cDCs), which are important promoters of T-cell activation and proliferation and express high levels of CD1d. iNKT cells were genetically modified to express a third-generation chimeric antigen receptor (CAR) against CD19 and showed robust cytotoxicity against CD19+ cell lines and patient blasts. Importantly, CD19-CAR-iNKT cells retained their CD1d restriction and could induce both CD19 and CD1d-mediated cytotoxicity. Although PD-1 checkpoint inhibition could not improve short-term cytotoxicity of CD19-CAR-iNKT cells, cytokine release and proliferation capacity were significantly increased in nivolumab-treated samples. Moreover, repetitive antigen encounters also had a negative effect on the functionality of CD19-CAR-iNKT cells, especially after three stimulation rounds. Nevertheless, this effect could be partially reversed upon checkpoint inhibition. Importantly, CD19-CAR-iNKT cells maintained their inhibitory properties and could prevent T-cell activation and proliferation even under checkpoint inhibition. Thus, this work demonstrates the potential of iNKT cells and CD19-CAR-iNKT cells in the context of immune tolerance and for tumor control. iNKT cells promote immune tolerance through selective apoptosis induction of cDCs, while sparing plasmacytoid DCs (pDCs). Meanwhile, genetically modified iNKT cells are able to promote efficient tumor control of CD19+ malignancies. Further, checkpoint inhibition may increase their functionality without exacerbating the risk of GvHD after allo-HSCT making them an ideal cytotherapeutic to treat relapse in this clinical setting.
Immunotherapy