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Der NO-GC/cGMP-Signalweg ist an zahlreichen physiologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der Thrombozytenhämostase. Die Dysregulation dieses Weges wurde mit der Entwicklung von kardiovaskulären Pathologien, einschließlich Thrombose, in Verbindung gebracht. Die Hemmung der Thrombozytenaktivierung wurde zuvor mit dem NO-GC/cGMP-Signalweg in Verbindung gebracht; die molekularen Mechanismen, die Modulation des Zytoskeletts und der Form von Blutplättchen beinhalten, wurden jedoch noch nicht untersucht. Wie sich die Thrombozytenbiomechanik auf die Thrombozytenfunktion auswirkt, ist noch eine Nische, die es zu erforschen gilt, daher liegt der Schwerpunkt dieser Dissertation auf dem Verständnis der zellulären Steifheit und Morphologie des Zytoskeletts in Thrombozyten.
Die Zellsteifigkeit wurde in humanen, Wildtyp- und Megakaryozyten-/Blutplättchen-spezifischen NO-GC KO-Mausplättchen gemessen, die mit NO-GC-Stimulator (Riociguat) und NO-GC-Aktivator (Cinaciguat) unter Verwendung von Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (SICM) inkubiert wurden. . Die Zirkularität und Fläche der Blutplättchen wurden mithilfe von Deep-Learning-basierter Blutplättchen-Morphometrie quantifiziert. F-Actin- und P-Selectin-Co-Immunfärbung wurden in menschlichen und murinen Blutplättchen unter Verwendung von Immunfluoreszenzmikroskopie gemessen. Die Freisetzung von P-Selectin (CD62P) aus α-Granula wird erhöht, wenn Blutplättchen aktiviert werden. Die relative Menge an p-VASP-Phosphorylierung und NO-GC in menschlichen und murinen Blutplättchen, die mit cGMP-modulierenden Arzneimitteln inkubiert wurden, wurde ebenfalls mit Western Blot quantifiziert.
Die P-Selectin-Freisetzung, die F-Actin-Polymerisation und die Zellsteifigkeit wurden um ≈50 % in mit Riociguat oder Cinaciguat stimulierten humanen und Wildtyp-Mausplättchen verringert. Die relative Menge an p-VASP in humanen und Wildtyp-Mausplättchen, die mit NO-GC-Stimulator oder -Aktivator inkubiert wurden, war im Vergleich zur Vehikelkontrolle erhöht. Die Hochregulierung von p-VASP ist mit einer Herunterregulierung von F-Aktin und zellulärer Steifheit verbunden. Die Zirkularität der Blutplättchen erhöhte sich um ≈50 % im Vergleich zur Vehikelkontrolle; jedoch wurden die Blutplättchenfläche und die relative Menge an NO-GC in menschlichen und Wildtyp-Mausblutplättchen, die mit cGMP-modulierenden Arzneimitteln stimuliert wurden, nicht verändert. Diese Ergebnisse legten nahe, dass der NO-GC-Signalweg die Zellsteifigkeit und -morphologie des Zytoskeletts in Blutplättchen moduliert, und ein pharmakologisches Targeting dieses Weges könnte als neuartige antithrombotische Therapie in Betracht gezogen werden.
Die klinische Anwendbarkeit von NO-GC-Stimulatoren (Riociguat oder Vericiguat) wurde auch bei HIV-positiven Patienten, die TFV- oder ABC-haltige Therapien einnahmen, im Vergleich zu HIV-negativen Patienten untersucht. Blutplättchenaggregation, endotheliale Mikropartikel (EMP)-Blutplättchenaktivierung, Crosstalk, Zirkularität, Fläche und F-Aktin-Polymerisation wurden untersucht. Riociguat und Vericiguat verringerten die Thrombozytenaggregation, Zirkularität und F-Aktin-Polymerisation bei HIV-negativen und HIV-positiven Patienten, die TFV-haltige Therapien einnahmen, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung des NO-GC/cGMP-Signalwegs die Thrombogenität bei Thrombozyten einschließlich HIV-positiver Patienten verringert Patienten, die TFV-haltige Regime einnehmen. Die bei HIV-positiven Patienten, die ABC-haltige Regime einnahmen, beobachtete fehlende Wirkung auf die Thrombozytenaggregation, Zirkularität und F-Aktin-Polymerisation wurde mit der Hemmung des NO-GC/cGMP-Signalwegs durch CBV-TP (aktiver Anabolit von ABC) in Verbindung gebracht. Diese Ergebnisse bestätigen das klinische Potenzial von NO-GC-Stimulatoren bei HIV-positiven Patienten durch Verringerung der Thrombozytenhyperaktivität.
Übermäßige Thrombozytenaktivierung löst verschiedene Herz-Kreislauf-Erkrankungen aus, indem sie Thrombosen verstärkt. ADP und Thrombin sind die wichtigsten Blutplättchenagonisten, die an der Blutplättchenaktivierung beteiligt sind. In physiologischer Umgebung befinden sich Blutplättchen in Blutkapillaren mit einer Größe zwischen 5 μm und 10 μm. Um physiologische Bedingungen nachzuahmen, wurden Blutplättchen biochemisch in fluoreszierende Fibrinogen-beschichtete Linien mit einer Breite von 5 μm und einer Periodizität von 15 μm eingeschlossen, die mittels Mikrokontaktdruck (μCP) in Zellkulturschalen gestempelt wurden. Die Auswirkungen des Einschlusses wurden in der Blutplättchenmorphologie und -mechanik untersucht. Die biochemische Begrenzung erhöhte die Blutplättchenfläche, das Seitenverhältnis, die Höhe und das Volumen in mit ADP aktivierten Blutplättchen, was darauf hindeutet, dass die Art des Blutplättchenagonisten die Blutplättchen-Fibrinogen-Überlappung beeinflusst. Die Steifheit der Blutplättchen verringerte sich im Einschluss im Vergleich zu nicht eingeschlossenen Blutplättchen. Die biochemische Begrenzung beeinflusst die Morphologie und Mechanik von Blutplättchen, folglich liefert diese Studie ein weiteres Verständnis der Blutplättchenaktivierung in einer relevanten physiologischen Umgebung. |
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