Platelet activation and immune response against platelet factor 4 in COVID-19 patients and after SARS-CoV-2 vaccination

Abstract

Thromboembolische Komplikationen sind eine häufige Manifestation von COVID-19 und gehen in der Regel mit einem multiplen Organversagen und einer hohen Sterblichkeit einher. Aktivierte Blutplättchen tragen zur COVID-19-Koagulopathie bei. Neuere Erkenntnisse deuten auf einen anhaltenden hyperkoagulierbaren und/oder hypofibrinolytischen Zustand bei rekonvaleszenten COVID-19-Patienten hin. Die Thrombozyten in der Rekonvaleszenzphase wurden jedoch bisher nicht untersucht. Darüber hinaus wurde eine seltene thrombotische und thrombozytopenische Komplikation, die Vakzin-induzierte immunthrombotische Thrombozytopenie (VITT), bei Adenovirus-basierten Vektorimpfstoffen gegen COVID-19 beschrieben. Bei der VITT aktivieren Antikörper, die auf den Plättchenfaktor 4 (PF4) reagieren, die Thrombozyten über den Fcγ-Rezeptor IIa (FcγRIIa) und führen zur Thrombusbildung sowie zur Abbau der Thrombozyten. Der Mechanismus der Entwicklung von Anti-PF4-Antikörpern ist nicht klar. In dieser Arbeit wollten wir die Antikörper-vermittelte Thrombozytenaktivierung bei COVID-19-Patienten in der Rekonvaleszenzphase und die Pathophysiologie der VITT untersuchen.

In einer prospektiven Studie untersuchten wir den Phänotyp der Blutplättchen mittels Durchflusszytometrie und die globale Gerinnung und Fibrinolyse mittels Thromboelastometrie bei rekonvaleszenten COVID-19-Patienten und Kontrollpersonen. Die Externalisierung von Phosphatidylserin (PS), die Expression von CD62P und die Ausschüttung von Glykoprotein VI (GPVI) wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen. Thrombozyten von COVID-19-Rekonvaleszenten wiesen keinen erhöhten prokoagulierenden Phänotyp auf. Darüber hinaus unterschied sich die GPVI-Abgabe nicht von der der Kontrollgruppe. Seren von COVID-19-Rekonvaleszenten induzierten bei gesunden Thrombozyten keine signifikant höhere PS-Externalisierung oder GPVI-Ausschüttung. In der Thrombelastometrie zeigte nur ein COVID-19-Rekonvaleszent eine erhöhte maximale Gerinnungsstärke und eine verlängerte Lysezeit. Folglich konnten wir in der Rekonvaleszenzphase nach einer milden COVID-19-Behandlung keine erhöhte Thrombozytenaktivierung/prokoagulierenden Phänotyp beobachten.

Anschließend konzentrierten wir uns auf das Verständnis der Entwicklung von Anti-PF4-Antikörpern bei Patienten mit einer VITT. Einer der möglichen Mechanismen ist die Kreuzreaktivität zwischen SARS-CoV-2 und PF4. Um die Korrelation zwischen Anti-PF4- und Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern zu untersuchen, wurden die Antikörperspiegel bei geimpften Kontrollen und bei Patienten mit klinischem Verdacht auf VITT nach der Impfung mit ChAdOx1 nCoV-19 gemessen. VITT-Patienten hatten höhere Anti-PF4-Antikörperspiegel als gesunde Kontrollpersonen und Nicht-VITT-Patienten. Die Anti-PF4-Werte korrelierten in keiner der Studiengruppen mit den Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern. Diese Ergebnisse widerlegen die Vermutung, dass die Entwicklung von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern zur Bildung von Anti-PF4-Antikörpern bei VITT-Patienten beiträgt.

Schließlich untersuchten wir die Auswirkungen einer intravenösen Immunglobulintherapie (IVIG) auf die Thrombozytenzahl und die Thrombozytenaktivierung bei VITT-Patienten. Alle Patienten erhielten ein alternatives Antikoagulans. Darüber hinaus wurde IVIG in einer Dosis von 1 g/KG Körpergewicht über 2 bis 5 Tage verabreicht. Vier Patienten zeigten nach der IVIG-Therapie ein vollständiges Ansprechen der Thrombozyten (Thrombozytenzahl ≥ 100×109/L) und ein Patient ein teilweises Ansprechen (Thrombozytenzahl ≥ 30×109/L und mindestens 2-facher Anstieg der Ausgangszahl). Die D-Dimer-Werte sanken nach der IVIG-Therapie, was auf eine Verringerung der Thrombuslast hinweist. Nach der IVIG-Therapie war die Fähigkeit der Seren von VITT-Patienten, in der Durchflusszytometrie prokoagulierende Thrombozyten zu induzieren, reduziert. Die Anti-PF4-Antikörperspiegel wurden durch die IVIG-Therapie jedoch nicht beeinflusst. Diese Daten deuten darauf hin, dass IVIG die Aktivität pathogener Anti-PF4-Antikörper abschwächt, indem es mit ihnen um die Bindung an FcγRIIa-Rezeptoren konkurriert, was mit einer Verringerung der Thrombozytenaktivierung in vivo verbunden sein könnte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Ergebnisse keine anhaltende Thrombozytenaktivierung in der Rekonvaleszenzphase von COVID-19 bestätigen. Außerdem sind die Antikörper gegen SARS-CoV-2 nicht für die Entwicklung von Anti-PF4-Antikörpern bei Patienten mit VITT verantwortlich. Zu guter Letzt ist eine hochdosierte IVIG-Therapie ein wirksames Mittel zur Abkühlung des hyperkoagulierbaren Zustands bei VITT-Patienten.

Thromboembolic complications are a hallmark of COVID-19 and are usually associated with multiple organ failure and high mortality. Activated platelets contribute to COVID-19 coagulopathy. Recent evidence suggests a persistent hypercoagulable and/or hypofibrinolytic state in convalescent COVID-19 patients. However, platelets in the convalescent period have not been studied to date. In addition, a rare thrombotic and thrombocytopenic complication, vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia (VITT), has been described after vaccination with adenoviral vector based COVID-19 vaccines. In VITT, antibodies reacting to platelet factor 4 (PF4) activate platelets via the Fcγ receptor IIa (FcγRIIa) and lead to thrombus formation as well as platelet destruction. The mechanism of anti-PF4 antibody development is not clear. In this work, we aimed to understand antibody–mediated platelet activation in COVID-19 patients in the convalescent phase and the pathophysiology of VITT.

In a prospective study, we investigated platelet phenotype by flow cytometry and global coagulation and fibrinolysis by thromboelastometry in convalescent COVID-19 patients and control subjects. Phosphatidylserine (PS) externalization, CD62P expression, and Glycoprotein VI (GPVI) shedding were measured by flow cytometry. Platelets from COVID-19 convalescents did not exhibit an increased procoagulant phenotype. In addition, GPVI shedding did not differ from that of the control group. Sera from COVID-19 convalescents did not induce significantly higher PS externalization or GPVI shedding in healthy platelets. In thromboelastometry, only one COVID-19 convalescent showed increased maximum clotting strength and prolonged lysis time. Consequently, we did not observe an increased platelet activation/procoagulant phenotype in the convalescent phase after mild COVID-19 treatment.

We then focused on understanding the development of anti-PF4 antibodies in patients with VITT. One of the proposed mechanisms is cross-reactivity between SARS-CoV-2 and PF4. To investigate the correlation between anti-PF4 and anti-SARS-CoV-2 antibodies, we measured antibody levels in vaccinated controls and in patients with clinical suspicion of VITT after vaccination with ChAdOx1 nCoV-19. VITT patients had higher anti-PF4 antibody levels than healthy controls and non-VITT patients. Levels of anti-PF4 did not correlate anti-SARS-CoV-2 antibodies in any of the study groups. These results refute the assumption that the development of anti-SARS-CoV-2 antibodies contributes to the formation of anti-PF4 antibodies in VITT patients.

Finally, we investigated the effects of intravenous immunoglobulin therapy (IVIG) on platelet count and platelet activation in patients with VITT. All patients received a non-heparin anticoagulant. In addition, IVIG was administered at a dose of 1 g/KG body weight for 2 to 5 days. Four patients showed a complete platelet response (platelet count ≥ 100×109/L) and one patient a partial response (platelet count ≥ 30×109/L and at least 2-fold increase in baseline count) after IVIG therapy. D-dimer levels decreased after IVIG therapy, indicating a reduction in thrombus burden. After IVIG therapy, the ability of sera from VITT patients to induce procoagulant platelets in flow cytometry was reduced. However, anti-PF4 antibody levels were not affected by IVIG therapy. These data suggest that IVIG attenuates the activity of pathogenic anti-PF4 antibodies by competing with them for binding to FcγRIIa receptors, which may be associated with a reduction in platelet activation in vivo.

In conclusion, our results do not confirm sustained platelet activation in the convalescent phase of COVID-19. Moreover, antibodies against SARS-CoV-2 are not responsible for the development of anti-PF4 antibodies in patients with VITT. Finally yet importantly, high-dose IVIG therapy is an effective means to cool down the hypercoagulable state in patients with VITT.