Ursprung und Regulation des 3-Methylglutaryl-Motivs in der Caprazamycin-Biosynthese

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 29. März 2025 !

Caprazamycine sind Liponucleosid-Antibiotika, die erstmals aus Streptomyces sp. MK730-62F2 isoliert wurden. Durch eine inhibitorische Wirkung auf die MraY-Translokase greifen sie in die Biosynthese der bakteriellen Zellwand ein. Sie zeigen Bioaktivität gegenüber grampositiven Bakterien, einschließlich dem klinisch relevanten Erreger Mycobacterium tuberculosis. Die Caprazamycine sind chemisch aus einen Grundgerüst bestehend aus Glycyluridin, 5-Amino-5-Deoxyribofuranose und einem permethylierten Diazepanon-Ring aufgebaut. Die Hydroxygruppe des Diazepanons trägt eine β-Hydroxyfettsäure. An deren β-Hydroxygruppe ist wiederum ein 3-Methylglutaryl-Rest verknüpft, der an der freien Carboxylgruppe eine permethylierte L-Rhamnose trägt. Die Biosynthese der Caprazamycine ist zu einem gewissen Maße untersucht, die Herkunft und Biosynthese des 3-Methylglutaryl-Motivs war bisher jedoch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit dem Caprazamycin-Gencluster und dem Primärmetabolismus des heterologen Produzenten Streptomyces coelicolor M1154 zwei Ursprünge dieses 3-Methylgluaryl-Motives identifiziert und sowohl genetisch als auch biochemisch näher charakterisiert. Zunächst wurden Gene des Caprazamycin-Genclusters untersucht, die an einem biosynthetischen Weg hin zu 3-Methylglutaryl-CoA beteiligt sein könnten. Hierfür kamen nach bioinformatischer Analyse die Gene cpz2, cpz5, cpz20 und cpz25 infrage. Durch Gendeletionen und genetischer Komplementierung konnte gezeigt werden, dass cpz5, cpz20 und cpz25 für die Bereitstellung von 3-Methylglutaryl-CoA benötigt werden. Cpz2 konnte auch nach zusätzlichen in-vitro-Experimenten keine Funktion in dieser Biosynthese zugeordnet werden. Gendeletionen sowie chemische und genetische Komplementierungen des Abbauwegs von Leucin und Isovalerat des heterologen Produzenten konnten zeigten, dass dieser Liu-Weg (leucine isovalerate utilization pathway) ebenfalls ein Intermediat für die Biosynthese von 3-Methylglutaryl-CoA bereitstellt. Interessanterweise sind Cpz20 und Cpz25 an beiden dieser Biosynthesewege beteiligt. Cpz25 setzt das zentrale Intermediat 3-Methylglutaconyl-CoA, welches von beiden Wegen gebildet wird, zu 3-Methylglutaryl-CoA um, während Cpz20 möglichweise an einem Aktivierungsschritt beteiligt ist. Zuletzt wurde der Regulator des liu-Genclusters auf einen möglichen Einfluss auf die Caprazamycin-Biosynthese untersucht. Eine Überexpression dieses Repressors führte zu einer verminderten Biosynthese der Caprazamycin-Aglycone, wogegen eine Gendeletion nicht zu einer Steigerung der Produktion führte. Zuletzt konnten Fütterungsexperimente mit L-Leucin, Isovaleryl-SNAc und 3-Methylcrotonyl-SNAc erste Hinweise darauf geben, dass diese als Liganden des Repressors agieren.