Cell wall recycling in Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis

Abstract

The bacterial cell is surrounded by a protective cell wall, which shields the cell from its environment and acts as a counterforce to the turgor. The bacterial life cycle of cell growth and division requires continuous adaptation of the cell wall, more specifically of its core structure, the peptidoglycan. During these restructuring processes, components of the peptidoglycan are released. Many bacteria have developed strategies for recycling of cell wall sugars and peptides to cope with a loss of resources. In Bacillus subtilis, recycling of the amino sugar N-acetylmuramic acid (MurNAc) involves the formation of MurNAc 6P, followed by intracellular conversion into GlcNAc 6P by the etherase MurQ. GlcNAc 6P can finally be introduced via further intermediate steps either into peptidoglycan synthesis or into glycolysis. Staphylococcus aureus and the Gram-negative organism Escherichia coli possess homologous enzymes that allow the recovery of extracellular MurNAc. However, both organisms release fragments of the peptidoglycan different than B. subtilis. Whilst in E. coli disaccharides with peptides attached are released and recycled, little is known about recycling in S. aureus.

In S. aureus, apparently disaccharides rather than monosaccharides are produced during autolysis and MurNAc-GlcNAc is released as the main turnover product. This work puts this fact in the context of the MurNAc recycling pathway.

In this work, it was shown that the PTS transporter MurP not only serves the uptake of the monosaccharide MurNAc, but also accomplishes the uptake and phosphorylation of the disaccharide MurNAc-GlcNAc. The resulting MurNAc 6P-GlcNAc, however, is not a direct substrate for the etherase MurQ. In S. aureus the MurNAc recycling operon comprises an additional gene whose theoretical translation product has no equivalent in either E. coli or in B. subtilis. The gene was shown to encode a phosphomuramidase that cleaves the disaccharide MurNAc 6P-GlcNAc to MurNAc 6P and GlcNAc. Accordingly, the enzyme was named MupG (for MurNAc 6P-glycosidase). The MurNAc 6P produced by MupG is subsequently processed by MurQ. MupG thereby represents an adaptation of the MurNAc recycling pathway to the needs of S. aureus. MupG is the first characterised representative of a protein family containing the domain of unknown function DUF871.

Bacteria have developed recycling strategies not only for cell wall sugars but also for cell wall peptides. E. coli imports cell wall peptides via an ABC transporter and processes them intracellularly in several steps. In this work, it was shown that B. subtilis encodes enzymes that enable degradation in a similar way. The γ-d-Glu-meso-Dpm endopeptidase YkfC hydrolyses unbranched and branched cell wall peptides into l-Ala-d-Glu and Dpm-containing residues. The dipeptide can be further metabolised after epimerisation into l-Ala-l-Glu. In contrast to E. coli, meso-Dpm in B. subtilis is almost exclusively amidated. This particular feature requires the activity of DppA, which de-amidates meso-Dpm and thereby enables YkfA to cleave the ld-bond between meso-Dpm and d-Ala in the Dpm-containing residues. The end product meso-Dpm of this sequential degradation can eventually be reused in peptidoglycan synthesis.

In conclusion, these findings provide further insights into the basic process of cell wall recycling. They also show that Gram-positive bacteria, despite lacking an outer membrane and thus are not able to retain cell wall turnover products in a periplasm, use similar recycling strategies as Gram-negative bacteria to salvage cell wall sugars and peptides.

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 15. Februar 2025 !

Die bakterielle Zelle ist von einer schützenden Zellwand umgeben, welche sie von ihrer Umgebung abschirmt und als Gegenkraft zum intrazellulären Turgor wirkt. Der bakterielle Lebenszyklus aus Zellwachstum und -teilung erfordert eine ständige Anpassung der Zellwand, genauer gesagt ihrer Kernstruktur, des Peptidoglykans. Während dieser Umstrukturierungsprozesse werden Bestandteile des Peptidoglykans freigesetzt. Viele Bakterien haben Strategien zur Wiederverwertung von Zellwandzuckern und -peptiden entwickelt, um den Verlust von Ressourcen zu kompensieren. In Bacillus subtilis umfasst die Wiederverwertung des Aminozuckers N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) die Bildung von MurNAc-6P, gefolgt von der intrazellulären Umwandlung in GlcNAc-6P durch die Etherase MurQ. GlcNAc-6P kann schließlich über weitere Zwischenschritte entweder in die Peptidoglykansynthese oder in die Glykolyse eingeführt werden. Staphylococcus aureus und das gramnegative Bakterium Escherichia coli verfügen über homologe Enzyme, die die Gewinnung von extrazellulärem MurNAc ermöglichen. Beide Organismen setzen jedoch andere Fragmente des Peptidoglycans als B. subtilis frei. Während in E. coli Disaccharide mit daran gebundenen Peptiden freigesetzt und wiederverwertet werden, ist über den Wiederverwertungsprozess in S. aureus wenig bekannt.

In S. aureus werden während der Autolyse offenbar eher Disaccharide als Monosaccharide produziert, und MurNAc-GlcNAc als Hauptumsatzprodukt freigesetzt. Die vorliegende Arbeit stellt diese Tatsache in den Kontext des MurNAc-Recyclingweges.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der PTS-Transporter MurP nicht nur der Aufnahme des Monosaccharids MurNAc dient, sondern auch die Aufnahme und Phosphorylierung des Disaccharids MurNAc-GlcNAc bewerkstelligt. Das entstehende MurNAc-6P-GlcNAc ist jedoch kein direktes Substrat für die Etherase MurQ. In S. aureus umfasst das MurNAc-Recycling-Operon ein zusätzliches Gen, dessen theoretisches Translationsprodukt weder in E. coli noch in B. subtilis eine Entsprechung hat. Hier wurde gezeigt, dass das Gen für eine Phosphomuramidase kodiert, welche das Disaccharid MurNAc-6P-GlcNAc in MurNAc-6P und GlcNAc spaltet. Entsprechend wurde das Enzym MupG (für MurNAc-6P-Glycosidase) genannt. Das von MupG produzierte MurNAc-6P wird anschließend von MurQ prozessiert. MupG stellt somit eine Anpassung des MurNAc-Recyclingweges an die Bedürfnisse von S. aureus dar. MupG ist der erste charakterisierte Vertreter einer Proteinfamilie, die die Domäne mit unbekannter Funktion DUF871 enthält.

Bakterien haben nicht nur für Zellwandzucker, sondern auch für Zellwandpeptide Wiederverwertungsstrategien entwickelt. E. coli importiert Zellwandpeptide über einen ABC-Transporter und verarbeitet sie intrazellulär in mehreren Schritten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass B. subtilis Enzyme kodiert, die den Abbau auf ähnliche Art und Weise ermöglichen. Die γ-d-Glu-meso-Dpm-Endopeptidase YkfC hydrolysiert unverzweigte und verzweigte Zellwandpeptide in l-Ala-d-Glu und Dpm-haltige Reste. Das Dipeptid kann nach Epimerisierung zu l-Ala-l-Glu weiter verstoffwechselt werden. Im Gegensatz zu E. coli, liegt meso-Dpm in B. subtilis fast ausschließlich amidiert vor. Diese Besonderheit erfordert die Aktivität von DppA, welches meso-Dpm deamidiert und dadurch YkfA ermöglicht, die ld-Bindung zwischen meso-Dpm und d-Ala in den Dpm-haltigen Resten zu spalten. Das Endprodukt meso-Dpm dieses sequenziellen Abbaus, kann schließlich in der Peptidoglykansynthese wiederverwendet werden.

Zusammengefasst, ermöglichen diese Ergebnisse weitere Einblicke in den grundlegenden Wiederverwertungsprozess der bakteriellen Zellwand. Sie zeigen auch, dass grampositive Bakterien, obwohl sie keine äußere Membran besitzen und daher nicht in der Lage sind, Zellwandumsatzprodukte in einem Periplasma zurückzuhalten, ähnliche Strategien zur Wiederverwertung von Zellwandzuckern und -peptiden anwenden wie gramnegative Bakterien.