Etablierung und molekulare Charakterisierung von Mammakarzinom-Organoiden

Abstract

Viele Frauen werden im Laufe ihres Lebens mit der Diagnose Mamma-Ca konfrontiert, und trotz bereits weit entwickelter Therapien stirbt noch eine große Anzahl dieser Frauen an ihrer Tumorerkrankung. Es bedarf deshalb weiterführender Forschung der Pathomechanismen von Brusttumoren sowie neuer Ansätze für Therapien. Organoide als „Mini-Modelle“ von Mamma-Ca können einen neuen Baustein für die Weiterentwicklung von Therapien darstellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Mamma-Ca-Organoide im Labor als Organoidlinien zu etablieren, ihren Aufbau aufzuschlüsseln und die Expression von Matrixkomponenten, ihrer Rezeptoren und von Matrix-Proteasen zu analysieren. Für die Bearbeitung der Aufgabenstellungen sollten Organoide aus Brustkrebsgewebe generiert werden, wobei sich die Kulturbedingungen v. a. an Protokollen der Arbeitsgruppe um Prof. Hans Clevers (Hubrecht Institute, Utrecht, Niederlande) orientieren sollten. Die zellulären Gewebeproben stammten von Patientinnen und Patienten der Universitäts-Frauenklinik Tübingen. Das erste Ziel (und Voraussetzung für die weitere Arbeit) war die erfolgreiche Etablierung von Organoidlinien (> 5 Passagen). Kryokonservierung und Fixierung der Brustkrebs-Organoide waren Teilaspekte der Arbeit, die bei den Organoidkulturen überprüft oder neu definiert werden mussten. Im nächsten Schritt wurde die Expression der für Parenchyme essenziellen Bauteile wie Laminine und Integrine, Marker für eine polare Differenzierung in basale und luminale Zellen sowie Vertreter der Matrix-Metalloproteasen und TIMPs qualitativ mittels Immunfluoreszenzfärbungen und RT-PCR-Analyse (reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction) untersucht. Der biologische Aufbau der Mamma-Ca-Organoide wurde in 2D-Techniken wie in 3D-Techniken untersucht und dabei herkömmliche Auflicht-Mikroskopie sowie neuere Multiphoton-/LSM-Mikroskopie angewandt. Die Immunfluoreszenzfärbung diente v. a. einer morphologischen Beurteilung der Organoide, an der abzulesen war, inwiefern sich der zelluläre Aufbau von Brustkrebs-Organoiden vom Originalgewebe ableiten ließ. Durch die Verwendung proteotypischer Marker für die Immunfluoreszenzfärbung konnte ein Vergleich zwischen den Organoidlinien angestellt und die Reproduzierbarkeit des Aufbaus direkt gegenübergestellt werden. Dem gegenüber sollte die RT-PCR-Analyse die Expression in einem detaillierteren Bild darstellen. Die grundlegende Untersuchung von Mamma-Ca-Organoiden hinsichtlich ihrer Repräsentativität für die Primärtumore ist das Fundament für weitere Schritte, die zur Entwicklung neuer Therapien führen können.