Strategien zur Optimierung der Adapter-CAR-NK-92-basierten Immuntherapie am Beispiel des Neuroblastoms

Abstract

Neuroblastome stellen mit einer relativen Häufigkeit von 5,5 % nach malignen hämatologischen Erkrankungen und ZNS-Tumoren die dritthäufigste Ursache maligner Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter dar. Da der Einschluss in die Hochrisikogruppe trotz intensiver Therapie mit einer Fünfjahresrate progressionsfreien Überlebens von kleiner als 50 % einhergeht, werden dringend neue Therapieoptionen benötigt. Die AdCAR-NK-92-basierte Immuntherapie ist ein standardisiertes, kostengünstiges Produkt mit vorteilhaftem Sicherheitsprofil und zuverlässiger Wirksamkeit, das nicht patientenindividuell gefertigt werden muss. In Kombination mit biotinylierten Antikörpern können AdCAR-NK-92-Zellen mehrere Tumor-assoziierte Antigene simultan oder sequentiell erkennen und einer Immunevasion des Tumors durch Herunterregulation der Zielstrukturen entgegenwirken. In der vorliegenden Arbeit wurde die AdCAR-NK-92-basierte Immuntherapie am Beispiel des Neuroblastoms im Hinblick auf Hürden bei der Therapie solider Tumore, die Beeinflussung ihrer Funktionalität durch Bestrahlung und die pharmakologische Kontrolle der CAR-Funktion untersucht. Methodisch wurden die Viabilität und Proliferation der AdCAR-NK-92-Zellen mittels MTS-Tests und Trypanblau-Vitalfärbungen untersucht. Zur Untersuchung der Zytotoxizität von AdCAR-NK-92-Zellen gegenüber Neuroblastom-Zelllinien wurden Calcein-Release-Tests durchgeführt. Die Analyse der Expression von Oberflächenantigenen auf Neuroblastom-Zelllinien und des NK-Zell-Rezeptorprofils auf AdCAR-NK-92-Zellen erfolgte durchflusszytometrisch. Zunächst wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass AdCAR-NK-92-Zellen in Kombination mit biotinylierten Antikörpern in der Lage sind, in vitro entsprechende Zytotoxizität gegenüber etablierten Neuroblastom-Zelllinien zu induzieren. Aufgrund ihrer hohen Expression auf den Neuroblastom-Zelllinien erwiesen sich vor allem die Antigene CD146 (MCAM) und CD171 (L1CAM) als geeignete Zielstrukturen. Im Hinblick auf das Tumormikromilieu solider Tumore wurde demonstriert, dass sich das immunsuppressive Zytokin TGFβ nicht auf die Viabilität von AdCAR-NK-92-Zellen auswirkt und auch ihre Zytotoxizität nur geringfügig einschränkt. Ob die TGFβ-induzierte Einschränkung der Zytotoxizität durch den TGFβ-Rezeptor-1-Inhibitor Galunisertib aufgehoben werden kann, konnte in dieser Arbeit nicht abschließend geklärt werden und sollte weiterführend untersucht werden. Bestrahlung stellt als Sicherheitsmaßnahme eine Voraussetzung für die Zulassung von Immuntherapien auf Basis von NK-92-Zellen dar. In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass eine Bestrahlung mit 10 Gy geeignet ist, um die Viabilität der AdCAR-NK-92-Zellen zu begrenzen, ohne ihre therapeutische Wirksamkeit mehr als notwendig zu beeinträchtigen. Weiterhin wurde demonstriert, dass die Zytotoxizität der AdCAR-NK-92-Zellen mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Dasatinib im Sinne eines molekularen Schalters pharmakologisch kontrolliert werden kann. Da bei Einsatz von Dasatinib eine vorübergehende und dosisabhängige Inhibition der Zytotoxizität erreicht wurde, stellt der Einsatz von Dasatinib eine Möglichkeit dar, die AdCAR-NK-92-Zellen im Falle unvorhergesehener Toxizität zu kontrollieren. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass AdCAR-NK-92-Zellen einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung des Neuroblastoms und gegebenenfalls weiterer solider Tumore darstellen.