Investigating the effect of the HilD inhibitor C26 on Salmonella pathogenicity mediated by the giant adhesin SiiE encoded on Salmonella pathogenicity island 4.

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 10. Januar 2025 !

The lab of Samuel Wagner has been developing the small molecule called Compound 26 (C26) as an anti-virulence agent against infections with the bacterial enteropathogen Salmonella Typhimurium. C26 targets the main transcriptional regulator of Salmonella pathogenicity HilD. In this work, the effect of C26 on Salmonella pathogenicity island 4 (SPI-4) and the giant non-fimbrial adhesin SiiE was investigated. In particular, analysis of the expression and assembly of the SPI-4 encoded T1SS via SDS-PAGE and BN-PAGE revealed that 100 μM C26 strongly reduced the expression of the T1SS ABC-transporter, SiiF, and impeded the assembly of this secretion system. The establishment of a HiBiT-LgBiT based SiiE secretion assay enabled the quantification of SiiE secretion into the culture medium. T3SS-1 dependent injection of SipA-HiBiT into HeLa-LgBiT cells was assessed using the previously established injection assay (Westerhausen et al. 2020). Using these assays, I was able to show that C26 reduced SiiE secretion and SipA-HiBiT injection in a dose-dependent manner. At concentrations of 100 μM C26 SiiE secretion was reduced to 2.6 % of the wild type level and SipA-HiBiT injection into HeLa-LgBiT cells was reduced to 5.6 % of the wild type level. As evidenced by an in vitro cell invasion assay, C26 reduced invasion of Salmonella into non-polarised HeLa and MDCK cells. Unfortunately, it was not possible to generate polarised monolayers of MDCK cells, which are a prerequisite for quantifying SPI-4 mediated adhesion to polarised epithelial cells (Gerlach et al. 2007b). In conclusion, this work showed that C26 reduced SiiF expression, T1SS assembly, SiiE secretion and attenuated the invasion capacity of Salmonella into host cells. Together, these findings strengthen the role of C26 as a promising new candidate for antimicrobial therapy.

Das Labor von Samuel Wagner hat das kleine Molekül Compound 26 (C26) als ein Anti-Virulenz-Mittel gegen Infektionen mit dem enteropathogenen Salmonella Typhimurium entwickelt. C26 zielt auf den Haupttranskriptionsfaktor für die Salmonella Pathogenität HilD. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von C26 auf die Salmonella Pathogenitätsinsel 4 (SPI-4) und das große nicht-fimbrilläre Adhäsin SiiE untersucht. Die Analyse der Expression und des Zusammenbaus des SPI-4 kodierten T1SS mittels SDS-PAGE und BN-PAGE ergab insbesondere, dass 100 μM C26 die Expression des T1SS ABC-Transporters SiiF deutlich reduzierte und den Zusammenbau dieses Sekretionssystems verhinderte. Die Etablierung eines HiBiT-LgBiT basierten SiiE Sekretions-Assays ermöglichte die Quantifizierung der SiiE Sekretion in das Kulturmedium. Die T3SS-1 abhängige Injektion von SipA-HiBiT in HeLa-LgBiT Zellen wurde mittels eines bereits früher etablierten Injektions-Assays bestimmt (Westerhausen et al. 2020). Durch die Nutzung dieser Assays konnte ich die dosisabhängige Reduktion der SiiE Sekretion und SipA Injektion durch C26 zeigen. Bei Konzentrationen von 100 μM C26 war die Sekretion von SiiE auf 2.6 % des Wildtyp-Werts und die Injektion von SipA-HiBiT in HeLa-LgBiT Zellen auf 5.6 % des Wildtyp-Werts reduziert. In einem in vitro Zellinvasions-Assay wurde gezeigt, dass C26 die Invasion von Salmonella in nicht polarisierte HeLa und MDCK Zellen reduzierte. Leider war es nicht möglich, polarisierte Monolayer von MDCK Zellen zu erzeugen, welche eine Voraussetzung für die Bestimmung der SPI-4 vermittelten Adhäsion an polarisierte Epithelzellen sind (Gerlach et al. 2007b). Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass C26 die Expression von SiiF, den T1SS Zusammenbau, die Sekretion von SiiE reduzierte und die Invasionskapazität von Salmonella in Wirtszellen abschwächte. Gemeinsam heben diese Ergebnisse die Rolle von C26 als einen vielversprechenden neuen Kandidaten für die antimikrobielle Therapie hervor.