Instrumental and Methodological Developments for Two-dimensional Capillary-Coupled Isotachophoresis/Electrophoresis-Mass Spectrometry

Abstract

Die Nachweisgrenzen in der Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE MS) sind aufgrund der sehr geringen Probenbeladbarkeit für einige Anwendungen, wie z. B. die Analyse von Spurenstoffen in der Umwelt, nicht ausreichend. Daher ist eine Anreicherung des Analyten erforderlich. Zur Verbesserung der Nachweisgrenzen kann die Isotachophorese, welche Analyte effektive anreichern kann, als zusätzliche Trenndimension mit der CE-MS gekoppelt werden. In dieser Studie wird ein kompakter 2D-Aufbau für die säulengekoppelte Isotachophorese/Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (ITP/CE-MS) basierend auf einem modifizierten kommerziellen CE-MS-Aufbau für die nachweisstarke Analyse von anionischen Analyten vorgestellt. Neben instrumentellen Arbeiten sind auch methodische Aspekte ein Schwerpunkt dieser Dissertation. Die ausgewählten Verbindungen, Glyphosat und seine Metaboliten, sind aufgrund ihrer hohen Ladung und Polarität von Natur aus schwierig durch chromatographische Verfahren zu analysieren. In der Regel müssen sie vor der Analyse derivatisiert werden. Dagegen eignen sich elektrophoretische Methoden ideal für geladene Analyten, da dies die Grundlage des Trennmechanismus darstellt und zudem geringe Probenvolumen analysiert werden können. Der ITP/CE-MS-Aufbau wurde in einem Hybridformat basierend auf Standardkapillaren und einem mikrofluidischen Glaschip als Schnittstelle mit integrierter Leitfähigkeitsdetektion entwickelt. Der intermediäre Detektor ermöglichte einen zuverlässigen Transfer der mittels ITP aufkonzentrierten Analyte zwischen den Trenndimensionen. Dank des Hybriddesigns war es möglich, ein einziges kommerzielles CE-MS-Gerät mit einem modifizierten Injektionssystem, einem dritten Vial-Halter (mit Druck beaufschlagbar, an Hochspannung anschließbar) und einer Hochspannungs-Schaltbox für ITP/CE-MS Messungen zu verwenden. Alle Modifikationen konnten flexibel in das CE-Gerät selbst eingebaut werden und erforderten keine Demontage des CE-Geräts. Dies ermöglichte ein schnelles Wechseln zwischen 2D- und 1D-Anwendung auf demselben Gerät. Um die Trennbedingungen für beide Dimensionen zu optimieren, wurden die pKS Werte und die elektrophoretischen Grenzmobilitäten für Glyphosat und seine Metabolite zwischen pH 1,2 und 12,0 durch Kapillarelektrophorese-Leitfähigkeitsdetektion (CE-C4D) mit sehr hoher Auflösung unter Verwendung geeigneter Puffersysteme und der kostenlosen AnglerFish-Software von Malý et al. bestimmt (Malý et al., Electrophoresis. 2020, 41, 493‑501). Durch die softwarebasierte Korrektur der Ionenstärkeeffekte auf die effektive elektrophoretische Mobilität der Analyte konnten erstmals die sehr niedrigen pKS -Werte der Analyten präzise bestimmt werden. Mit diesen Daten wurden optimale Trennbedingungen für die CE bei unterschiedlichen pH-Werten simuliert und experimentell bestätigt. CE-MS wurde erfolgreich auf reale Proben angewendet. Die Ergebnisse zeigten, dass Phosphat die kritischste Matrixkomponente ist. Parallel dazu wurde die ITP-MS Trennung optimiert, um neben der Anreicherung der Analyte auch die effektive Abtrennung von Phosphat sicherzustellen, sodass es nicht im ITP-Stack enthalten ist. Schließlich wurden ITP-C4D/CE-MS-Messungen durchgeführt, um Glyphosat in wässrigen Proben zu analysieren, wobei hervorragende Nachweisgrenzen im pikomolaren Bereich erreicht wurden.

The very low sample loadability of a few nanoliters precludes the application of capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS) in environmental trace analysis. Therefore, analyte enrichment is required to achieve the desired limits of detection. This can be achieved using the inherent preconcentration abilities of isotachophoresis (ITP), when coupled online to CE-MS. In this study, a compact 2D setup for column-coupled isotachophoresis capillary electrophoresis-mass spectrometry (ITP/CE-MS) based on a modified commercial CE MS setup for the sensitive analysis of anionic analytes is presented. Beside instrumental inventions, methodological aspects are a major focus of this thesis. The selected model compounds, glyphosate and its metabolites, are inherently difficult to analyze by chromatographic methods due to their high charge and polarity, necessitating derivatization. In contrast, electrophoretic methods are ideal, because their separation mechanism requires charged analytes and allow to analyze very sample volumes The ITP/CE-MS setup was developed as a hybrid solution based on standard capillaries and a microfluidic glass chip as interface with integrated conductivity detection. This intermediate detector enabled to reliably transfer the stack of analytes between the separation dimensions. Thanks to the hybrid design, it was possible to use a single commercial CE-MS device with a modified injection system, a third vial holder (pressurizable, connectable to high voltage) and a high voltage switching box for ITP/CE-MS measurements. All modifications were flexibly installed in the commercial CE instrument and did not require any disassembly of the CE instrument. This allowed fast switching between 2D and 1D applications on the same device. To optimize the separation conditions for both dimensions, the pKa values and limiting electrophoretic mobilities for glyphosate and its metabolites were determined between pH 1.2 and 12.0 by CE coupled to conductivity detection (CE C4D) at a very high resolution using suitable buffer systems and the free AnglerFish software developed by Malý et al. (Malý et al., Electrophoresis. 2020, 41, 493‑501). Thanks to the software-based correction of ionic strength effects on the analytes’ effective electrophoretic mobility, the very low pKa values of the analytes were precisely determined for the first time. With these data, optimal separation conditions for CE at different pH values were simulated and confirmed in experiments. CE-MS was successfully applied to real samples. The results revealed that phosphate is the most critical matrix component. In parallel, ITP-MS was optimized to ensure preconcentration of analytes as well as an effective separation from phosphate, not included in the ITP stack. Finally, ITP-C4D/CE-MS measurements were conducted to analyze glyphosate in aqueous samples achieving impressive limits of detection in the picomolar range.