Analysis of the somatic and germline genomes of the ciliate Blepharisma stoltei

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URI: http://hdl.handle.net/10900/134524
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1345249
http://dx.doi.org/10.15496/publikation-75875
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2022-12-21
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biochemie
Advisor: Swart, Estienne (Dr.)
Day of Oral Examination: 2022-10-06
Keywords: Genom , RNS , Transposase , Transposon
Other Keywords: Genomik
Wimperntierchen
PiggyBac
Ciliates
Genomics
PiggyBac
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Ciliaten sind prototypische, üblicherweise einzellige Eukaryoten mit getrennten Keimbahn- und somatischen Zellkernen. Das somatische Genom entsteht aus dem Keimbahngenom durch einen Prozess der Transposase-vermittelten DNA-Eliminierung und Genom-Neuordnung während der sexuellen Fortpflanzung. Aktuelle Modelle für die Reorganisation des Genoms bei Wimpertierchen gehen davon aus, dass kleine RNAs während der sexuellen Fortpflanzung in den sich entwickelnden somatischen Kern transportiert werden und Transposasen dabei helfen, keimlinienspezifische Sequenzen zu identifizieren und auszuschneiden. Diese Sequenzen, die so genannten intern eliminierten Sequenzen (IES), und ihre Exzisasen werden von einer Maschinerie begleitet, die ihre Entfernung durchführt. Dazu gehören Dicer-ähnliche und Piwi/Argonaute-Proteine, die kleine RNAs erzeugen und transportieren, sowie Proteine, die das Chromatin verändern und die DNA für die Exzision zugänglich machen. Blepharisma gehört zu einer früh divergiereden Klasse von Ciliaten, die als Heterotrichea bekannt sind. Obwohl die Reorganisation des Genoms bei später divergierenden Ciliaten wie den oligohymenophoren Ciliaten Tetrahymena und Paramecium und den spirotrichen Oxytricha untersucht wurde, gibt es deutliche Unterschiede in der Art und Weise, wie sie dies tun. Die Untersuchung dieses Prozesses in einem früh divergiereden Ciliaten wie Blepharisma ist ein wichtiger Beitrag zum Verständnis, wie konserviert die verschiedenen Elemente der Genom- Reorganisationsmaschinerie unter Ciliaten sind. Diese Arbeit bietet den ersten Blick aus genomischer Sicht auf die verschiedenen Teilnehmer und mutmaßlichen Mechanismen der Genomreorganisation in Blepharisma. Mittels Long-Read-Sequenzierung und Annotationsmethoden, die auf die atypischen Genomeigenschaften von Blepharisma zugeschnitten sind, wurden annotierte Referenzgenome für die somatischen und Keimbahnkerne von Blepharisma stoltei (Stamm ATCC 30299) erstellt. Das somatische Genom von B. stoltei ist kompakt (41 Mb), gen-dicht (25710 Gene) und enthält kurze, 15-16 Nukleotide umfassende spliceosomale Introns. Wir haben Schlüsselkomponenten identifiziert, die an der Reorganisation des Genoms im somatischen Genom von Blepharisma beteiligt sind, und sie mit denen der Modell-Ciliaten Paramecium, Tetrahymena und Oxytricha verglichen. Es wurden vier Transposase-Familien gefunden, die in den somatischen und Keimbahn-Genomen kodiert sind, nämlich die PiggyBac-,Tc1/Mariner-, Mutator- und Merlin-Familien. Es ist bekannt, dass PiggyBac-Transposasen die wichtigsten Transposasen sind, die in den Modell-Ciliaten Paramecium und Tetrahymena an der Reorganisation des Genoms beteiligt sind, während sie in Oxytricha, wo vermutlich eine Transposase aus einer anderen Familie verwendet wird, gänzlich fehlen. In Paramecium koordinieren sechs somatisch kodierte PiggyBacs, die nicht zur Katalyse fähig sind, sowie ein katalytisch vollständiges Homolog, namens PiggyMac, die DNA-Exzision. Dies ähnelt der Situation in Blepharisma, wo es dreizehn Homologe der PiggyBac-Transposase gibt, von denen nur eine eine vollständige katalytische Triade besitzt und daher wahrscheinlich die primäre Exzisase ist. Die keimbahnbegrenzten genomischen Regionen von Blepharisma wurden ebenfalls charakterisiert. Die IES von Blepharisma haben zwei wesentliche Merkmale mit den IES von Paramecium gemeinsam, nämlich eine periodische Längenverteilung für kurze IES und überwiegend durch TA-Dinukleotide abgegrenzte IES-Grenzen. Wir haben auch eine Klasse von kleinen RNAs („small RNAs“ ) mit 24 Nukleotiden identifiziert, die mit fortschreitender Entwicklung in Blepharisma zunehmend den IESs zugeordnet werden. Diese Tendenzen ähneln denen, die in Paramecium und Tetrahymena beobachtet wurden, weshalb wir vorschlagen, dass es sich auch hier um so genannte "Scan"-RNAs (scnRNAs) handelt, die die IES-Exzision steuern. Die phylogenetische Analyse der PiggyBac-Homologe von Blepharisma hat gezeigt, dass sie einen gemeinsamen Ursprung mit den PiggyBac-Homologen von Paramecium und Tetrahymena haben, wobei letztere evolutionär stärker divergieren als Blepharisma und auf jüngeren Zweigen des phylogenetischen Stammbaums der Ciliaten zu finden sind. Mehrere Indizien aus diesen Studien deuten daher darauf hin, dass eine PiggyBac-Transposase höchstwahrscheinlich die wichtigste IES-Exzisase in Blepharisma ist und dass der letzte gemeinsame Vorfahre der Ciliaten ebenfalls diesen Transposasetyp besaß.

Abstract:

Ciliates are prototypical, conventionally unicellular eukaryotes with separate germline and somatic nuclei. The somatic genome arises from the germline genome through a process of transposase-mediated DNA elimination and genome rearrangement during sexual reproduction. Current models for genome reorganization in ciliates posit that small RNAs are transported to the developing somatic nucleus during sexual reproduction, aiding transposases in identifying and excising germline-specific sequences. Accompanying these sequences, known as Internally Eliminated Sequences (IESs), and their excisases is the machinery to carry out their removal. This includes Dicer-like and Piwi/Argonaute proteins, which generate and transport small RNAs, as well as proteins that alter chromatin, and make DNA accessible for excision. The ciliate Blepharisma belongs to an early diverging class of ciliates known as the Heterotrichea. Though genome reorganization has been studied in later diverging ciliates such the oligohymenophorean ciliates Tetrahymena and Paramecium and the spirotrich Oxytricha there are pronounced differences in how they do so. Studying this process in an early diverging ciliate like Blepharisma is an important contribution to the understanding of how conserved the different elements of the genome reorganization machinery among ciliates are. This thesis provides the first look, from a genomic perspective, at the various participants and putative mechanisms of genome reorganization in Blepharisma. Annotated reference genomes for the somatic and germline nuclei of Blepharisma stoltei (strain ATCC 30299) were generated using long-read sequencing and annotation methods tailored to the atypical genome properties of Blepharisma. The B. stoltei somatic genome is compact (41 Mb), gene-dense (25710 genes) and contains short, 15-16 nucleotide spliceosomal introns. We identified key components involved in genome reorganization in the Blepharisma somatic genome and compared them with those of the model ciliates Paramecium, Tetrahymena and Oxytricha. Four transposase families were found encoded in the somatic and germline genomes, namely the PiggyBac, Tc1/Mariner, Mutator and Merlin families. PiggyBac transposases are known to be the main transposases involved in genome reorganization in the model ciliates Paramecium and Tetrahymena, but are entirely absent in Oxytricha, which is thought to use a transposase from another family. In Paramecium, six somatically encoded PiggyBacs incapable of catalysis, plus one catalytically complete homolog called the PiggyMac, coordinate DNA excision. This resembles the situation in Blepharisma, which has thirteen homologs of the PiggyBac transposase, only one of which has a complete catalytic triad and is hence likely to be the primary excisase. The germline-limited genomic regions of Blepharisma were also characterized. Blepharisma IESs share two key features with the IESs of Paramecium, namely a periodic length distribution for short IESs and predominantly TA-dinucleotide delineated IES boundaries. We also identified a class of 24-nucleotide small RNAs that increasingly map to IESs as development progresses in Blepharisma. These trends are similar to those observed in Paramecium and Tetrahymena, hence we propose that they are also so-called “scan” RNAs (scnRNAs) that guide IES excision. Phylogenetic analysis of the Blepharisma PiggyBac homologs showed that they share common ancestry with the PiggyBac homologs of Paramecium and Tetrahymena, where the latter are evolutionarily more divergent than Blepharisma and are located on more recently diverging branches of the ciliate phylogenetic tree. Several lines of evidence from these studies therefore indicate that a PiggyBac transposase is the most likely the main IES excisase in Blepharisma and that the last ciliate common ancestor also possessed this type of transposase.

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