Tailoring Clostridium ljungdahlii for Improved Ethanol Production by Genetic Engineering of the Aldehyde:Ferredoxin Oxidoreductase (AOR) and Chemostat Fermentation

Abstract

One of today’s major global challenges is the continued global warming and emissions of greenhouse gases. In recent years, the effects of increasing global surface temperatures have become more and more pronounced. Society is facing reoccurring extreme weather events, such as floodings, extreme droughts, and storms. Ecosystems are destroyed and formerly inhabited areas become uninhabitable. To halt the increase of the global temperature and consequently prevent further damage, it is essential to contain greenhouse gas emissions. The most recent report from the Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) shows that to restrict global warming to 1.5°C, global net-zero carbon dioxide emissions must be achieved in the early 2050s. As a means of achieving that, a transition towards a circular economy is necessary. Synthesis gas fermentation is a very promising technology to recycle gas mixtures containing carbon dioxide (CO2), hydrogen gas (H2), and carbon monoxide (CO). Acetogenic bacteria fix the carbon from the gas mixture and convert it to acetate and ethanol. These chemicals can either be used directly, for example, ethanol can be used as a drop-in fuel, or further converted to value-added products for the chemical industry. The process allows for simultaneous recycling of waste gases and the production of platform chemicals or biofuels. Acetogens utilize an ancient linear pathway for carbon fixation, the Wood-Ljungdahl pathway, thriving at the thermodynamic limit of life. The Wood-Ljungdahl pathway produces no net ATP, and energy conservation is facilitated via two membrane-bound complexes, a Rhodobacter Nitrogen Fixation‐like complex (Rnf) and an ATPase. Clostridium ljungdahlii is a model acetogen, which has been isolated from chicken yard waste and described in 1993. Since then, researchers have put effort into sequencing and annotating the genome, developing genome editing tools, and optimizing fermentation conditions to achieve maximum production rates of the fermentation products. Recent results show that an aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) is a key enzyme in the ethanol production pathway during autotrophic growth. The genome of C. ljungdahlii contains three genes for the AOR, two tungsten-containing variants (CLJU_c20110, CLJU_c20210), and the more oxygen-tolerant molybdenum-containing variant (CLJU_c24130). The AOR reduces acetic acid to acetaldehyde using reduced ferredoxin (Fdred). Acetaldehyde is converted to ethanol by an alcohol dehydrogenase in a thermodynamically favorable reaction, making the AOR reaction a rate-limiting step. In this dissertation, we focus on elucidating the roles of the two isoforms AOR1 and AOR2 for ethanol production in C. ljungdahlii. We present an efficient CRISPR/Cas9 genome editing tool. We apply this tool for the deletion of aor genes individually and in combination, and present the reported phenotype changes. Additionally, we conceptualize a system for heterologous and homologous production of AOR enzymes and ferredoxin in Escherichia coli. Finally, we present the first characterization of C. ljungdahlii wildtype during chemostat fermentation using CO as the sole carbon and energy source. We show that ethanol production can be enhanced drastically by more than 230% by adding external acetate to the feed medium.

Eine der größten globalen Herausforderungen unserer Zeit ist die anhaltende globale Erderwärmung und der fortwährende Ausstoß von Treibhausgasen. In den letzten Jahren haben sich die Auswirkungen des Anstiegs der globalen Oberflächentemperaturen immer stärker bemerkbar gemacht. Unsere Gesellschaft ist mit immer wiederkehrenden extremen Wetterereignissen wie Überschwemmungen, extremen Dürren und Stürmen konfrontiert. Ökosysteme werden zerstört und ehemals bewohnte Gebiete werden unbewohnbar. Um den Anstieg der globalen Temperatur zu stoppen und damit weitere Schäden zu verhindern, müssen die Treibhausgasemissionen unbedingt eingedämmt werden. Aus dem jüngsten Bericht des Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) geht hervor, dass die Kohlendioxidemissionen bis Anfang der 2050er Jahre weltweit auf Null reduziert werden müssen um die globale Erderwärmung auf 1,5°C zu begrenzen. Um dies zu erreichen ist ein Übergang zu einer Kreislaufwirtschaft erforderlich. Die Synthesegasfermentation ist eine vielversprechende Technologie, um Gasgemische aus Kohlendioxid (CO2), Wasserstoff (H2) und Kohlenmonoxid (CO) zu recyceln. Acetogene Bakterien binden den Kohlenstoff aus dem Gasgemisch und wandeln ihn in Acetat und Ethanol um. Diese Chemikalien können entweder direkt verwendet werden, z. B. kann Ethanol als Drop-in-Kraftstoff eingesetzt werden, oder sie werden zu höherwertigen Produkten für die chemische Industrie weiterverarbeitet. Das Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Verwertung von Abgasen und die Herstellung von Plattformchemikalien oder Biokraftstoffen. Acetogene Bakterien nutzen einen evolutionär ursprünglichen, linearen Stoffwechselweg zur Kohlenstofffixierung, den Wood-Ljungdahl-Weg. Dieser Stoffwechselweg ermöglicht keine Netto-ATP-Produktion, daher werden für die Energieproduktion zwei membrangebundene Komplexe, der Rhodobacter Nitrogen Fixation‐like complex (Rnf) und eine ATPase, benötigt. Clostridium ljungdahlii ist ein Modellorganismus, der 1993 aus Hühnerhofabfällen isoliert und beschrieben wurde. Seitdem haben Forschende das Genom sequenziert und annotiert, gentechnische Werkzeuge entwickelt und die Fermentationsbedingungen optimiert, um maximale Produktionsraten der Fermentationsprodukte zu erzielen. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass eine Aldehyd:Ferredoxin-Oxidoreduktase (AOR) ein Schlüsselenzym des Ethanol-Produktionsweges während des autotrophen Wachstums ist. Das Genom von C. ljungdahlii enthält drei Gene für die AOR, zwei wolframhaltige Varianten (CLJU_c20110, CLJU_c20210) und die sauerstofftolerantere molybdänhaltige Variante (CLJU_c24130). Die AOR reduziert Essigsäure mit Hilfe von reduziertem Ferredoxin (Fdred) zu Acetaldehyd. Dieses Acetaldehyd wird durch eine Alkoholdehydrogenase in einer thermodynamisch günstigen Reaktion in Ethanol umgewandelt, wodurch die AOR-Reaktion zu einem geschwindigkeitslimitierenden Schritt wird. Der Fokus dieser Dissertation liegt auf der Entschlüsselung der Rollen der beiden Isoformen AOR1 und AOR2 für die Ethanol Produktion in C. ljungdahlii. Wir stellen ein effizientes CRISPR/Cas9-Genome-Editing-Werkzeug vor. Wir nutzen dieses Werkzeug für die Deletion von aor Genen einzeln und in Kombination und stellen die beobachteten Veränderungen des Phänotyps vor. Außerdem konzipieren wir ein System für die heterologe und homologe Produktion von AOR-Enzymen und Ferredoxin in Escherichia coli. Abschließend präsentieren wir die erste Charakterisierung von C. ljungdahlii Wildtyp während einer Chemostat-Fermentation unter Verwendung von CO als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle. Wir zeigen, dass die Ethanolproduktion durch die Zugabe von externem Acetat zum Nährmedium drastisch um mehr als 230% gesteigert werden kann.