Etablierung einer Transfektionsmethode für humane Kieferperiostzellen

Abstract

Stammzellen eröffnen der regenerativen Medizin durch ihr großes Differenzierungspotential ungeahnte Möglichkeiten. Die Anwendung von embryonalen Stammzellen wird jedoch kontrovers diskutiert. Patienteneigene, adulte Stammzellen sind ethisch unbedenklich, erzeugen keine immunologischen Reaktionen und sind leicht verfügbar. Aber sie haben ein geringes Differenzierungspotential, können sich also nicht in jede Zellart entwickeln und zeigen ein deutlich niedrigeres Proliferationspotential als beispielsweise embryonale Stammzellen. Die erstmals von Yamanaka und Kollegen im Jahr 2006 generierten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) vereinen viele positive Aspekte von embryonalen und adulten Stammzellen. Die ersten Methoden zur Gewinnung von iPS-Zellen bargen die Gefahr der Integration von fremdem Erbgut in das Genom der menschlichen Zellen, was eine klinische Anwendung untersagte. Derzeitige integrations- und xenofreie Methoden zur Generierung von iPS-Zellen sind häufig ineffizient und teilweise mit einer hohen Zellsterblichkeit verbunden. Ziel ist es, eine effektive, zellschonende und leicht reproduzierbare Methode zu entwickeln, die frei ist von immunreaktiven Substanzen und xenogenem Material. Auch wenn inzwischen iPS-Zellen schon vereinzelt in klinischen Studien zum Einsatz kamen, müssen noch etliche Hürden in Bezug auf die Generierung, Kultivierung und Langzeitkonservierung überwunden werden.

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode zur Transfektion von humanen Kieferperiostzellen, die in serumfreien MesenCult-Medium gezüchtet wurden. Die Zellen wurden mit Hilfe einer modifizierten, GFP-markierten mRNA transfiziert, was eine quantitative Beurteilung der Transfektionsraten ermöglichte. Die Integration von fremdem Erbgut ins Genom der Zielzelle ist hier ausgeschlossen. Vor der Lagerung in Stickstoff zeigten serumfrei kultivierte Kieferperiostzellen, auch nach Ausschluss von Ausreißern, für alle drei Transfekte nur sehr geringe Transfektionseffizienzen von unter 30 %. Nach Kryokonservierung wurden zum Teil signifikant höhere Transfektionseffizienzen von bis zu 86,6 % mit dem Transfekt Lipofectamine3000 erzielt. Da sich neben der hohen Erfolgsquote, eine vertretbaren Zytotoxizität in der Fluoreszenz-mikroskopie abzeichnete, wurde Lipofectamine3000 für die folgenden Versuche als alleiniges Transfekt verwendet. Die für die MesenCult-Zellen der Zellpassage 5 erreichten Transfektions-effizienzen nach vorheriger Stickstofflagerung konnten bei der Transfektion von Zellen der Zellpassagen 6 nicht reproduziert werden, wie ein weiterer Versuch zeigte. In einem abschließenden Versuch wurde der Einfluss von mehrmaliger Transfektion auf die Transfektionseffizienz untersucht. Das Erfolgsmaximum lag nach 48 Stunden und einmaliger Transfektion bei durchschnittlich 73,6 % GFP-positiver Zellen. Nach zweimaliger Transfektion zeigten sich nach 96 Stunden noch 62,5 % der Zellen positiv. Die geringste Menge an GFP-positiven Zellen (56,8 %) bei gleichzeitig hoher Zellsterblichkeit wurde nach dreimaliger Transfektion detektiert. Die Verwendung von weiter modifizierter mRNA, zusätzlicher microRNA oder gar selbst-replizierender RNA stellt weitere vielversprechende Methoden für eine sichere und effiziente Generierung von iPS-Zellen dar. Die Unterdrückung proinflammatorischer Signalwege mit Hilfe eines Interferon-Inhibitors scheint bei vielen Methoden unumgänglich. Eine sichere und effiziente Methode zur Generierung von iPS-Zellen ermöglicht, neben der Schaffung von individuellen patientenspezifischen Gewebetransplantaten, auch die Verwendung in der Entwicklung von Medikamenten und der Simulation von Krankheitsmodellen.