Biogenesis of the core components SpaP, SpaQ and SpaR of the Salmonella type III secretion system

Abstract

The T3SS is an important pathogenicity factor of Salmonella enterica Typhimurium. It is used to inject proteins directly into the host cell and enables the uptake of bacteria by intestinal cells. The correct assembly of a central component of the T3SS, the export apparatus, is crucial for the function of this molecular machine. The order of the genes encoding for the subunits of the export apparatus is highly conserved. In the present work, the effects of a changed order of the genes spaP, spaQ and spaR on the assembly and function of the T3SS were investigated. A S. Typhimurium ΔspaPQRS SipA-NL was used as background strain for the episomal expression of the spaPQRS operon with different permutations. Complex formation was investigated by BN PAGE analysis, and protein expression by SDS-PAGE analysis. Functionality of the system was estimated on the basis of effector secretion levels as quantified via the SipA-NanoLuc assay. The comparison of the different complexes revealed a significant reduction of the secretion ability of all constructs with altered gene order compared to spaPQRS+. Among the most functional variants are those that show a SpaQ remnant peptide between spaP and spaR. Nonetheless, these do show a reduced secretion activity to 27.56% and 21.25%, respectively. Surprisingly, both the variants with a shortened spaPR transition without the SpaQ remnant peptide as well as those with a nonsense-mutation in the SpaQ remnant peptide have a drastically reduced secretion activity, i.e. below 1%. The most important finding of the work is the demonstration of the functional relevance of the conserved gene order. Furthermore, the data show that spaQ has a regulatory function that can be partially executed even when the gene is shortened to 54 base pairs. The role of SpaQ as well as the presence of possible defective intermediate complexes such as SpaP6 and the SpaRx-self-assemblies will require further investigation. Nevertheless, the work contributed to a better understanding of the assembly of the export apparatus and confirmed the importance of spaQ and the translational coupling of spaQ and spaR.

Dissertation ist gesperrt bis 30.07.2024 !

Das T3SS ist ein wichtiger Pathogenitätsfaktor von Salmonella enterica serovar Typhimurium. Es dient der Injektion von Proteinen direkt in die Wirtszelle und ermöglicht die Aufnahme von Bakterien in die Darmzellen. Der korrekte Zusammenbau einer zentralen Komponente des T3SS, des Exportapparats, ist entscheidend für die Funktion dieser molekularen Maschine. Die Reihenfolge der Gene, die für die Untereinheiten des Exportapparates kodieren, ist hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen einer veränderten Anordnung der Gene spaP, spaQ und spaR auf den Aufbau und die Funktion der T3SS untersucht. S. Typhimurium ΔspaPQRS SipA-NL diente als Stamm für die episomale Expression des spaPQRS-Operons mit verschiedenen Permutationen. Die Komplexbildung wurde mittels BN-PAGE-Analyse und die Proteinexpression mittels SDS-PAGE-Analyse untersucht. Die Funktionalität des Systems wurde auf Basis der Effektorsekretionswerte geschätzt, die mittels SipANanoLuc- Assay quantifiziert wurden. Der Vergleich der verschiedenen Komplexe ergab eine signifikante Reduktion der Sekretionsfähigkeit aller Konstrukte mit veränderter Genreihenfolge im Vergleich zu spaPQRS+. Zu den funktionellsten Varianten gehören diejenigen mit SpaQ-Restpeptid zwischen spaP und spaR. Nichtsdestotrotz zeigen diese eine reduzierte Sekretionsaktivität auf 27,56% bzw. 21,25%. Überraschenderweise haben sowohl die Varianten mit einem verkürzten spaPR-Übergang ohne das SpaQ-Restpeptid als auch die Varianten mit einer Nonsense-Mutation im SpaQ-Restpeptid eine drastisch reduzierte Sekretionsaktivität, d.h. unter 1%. Das wichtigste Ergebnis der Arbeit ist der Nachweis der funktionellen Relevanz der konservierten Genreihenfolge. Zudem zeigen die Daten, dass spaQ eine regulatorische Funktion hat, die teilweise auch ausgeführt werden kann, wenn das Gen auf 54 Basenpaare verkürzt ist. Die Rolle von SpaQ sowie das Vorhandensein möglicher defekter Intermediärkomplexe wie SpaP6 und der SpaRx bedürfen weiterer Untersuchungen. Dennoch konnte die Arbeit einen Beitrag zum besseren Verständnis des Exportapparates leisten und die Bedeutung von spaQ und der translatorischen Kopplung von spaQ und spaR bestätigen.