Establishment and characterization of advanced hepatic cell culture models for the early assessment and mechanistic understanding of drug-induced liver injury

Abstract

Die Arzneimittelentwicklung ist ein sehr zeit- und kostenaufwändiger Prozess, der viele in-vitro- und in-vivo-Studien erfordert. Trotz zahlreicher Studien scheitern über 90 % der Arzneimittel-kandidaten in der präklinischen oder klinischen Phase aufgrund unzureichender Sicherheit und Wirksamkeit [1]. Die arzneimittel-induzierte Lebertoxizität (DILI) ist eine der häufigsten Ursa-chen für die hohe Misserfolgsquote und die Rücknahme bereits zugelassener Arzneimittel. Bislang ist der hohe Verlust neuer Arzneimittelkandidaten aufgrund unvorhersehbarer Hepato-toxizität ein großes Problem für die Pharmaindustrie. Die Kombination aus den primitiven hu-manen Testmodellen in toxikologischen Studien, dem lückenhaften Verständnis des DILI-Mechanismus und dem Mangel an empfindlichen, zuverlässigen Biomarkern erschweren die frühe Bestimmung des DILI-Potentials eines neuen Medikaments. Der Goldstandard für he-patotoxische Experimente sind primäre humane Hepatozyten, die flach auf einer optimierten Kunststoffoberfläche kultiviert werden. Durch die Isolation aus dem Zellverband und die organ-untypische Kultivierung verlieren sie sehr schnell ihre physiologischen Eigenschaften und Funktionalität. Deshalb rücken seit einigen Jahren erweiterte Zellkultursysteme immer mehr in den Fokus. Durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen in vitro, kann die Funk-tionalität der primären Leberzellen länger erhalten werden was toxikologische Langzeit-Versuche ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung von erweiterten Leberzellkulturmodellen und die Unter-suchung neuer, potenzieller Biomarker für die in vitro-Identifizierung der DILI. Die Charakteri-sierung der Modelle bestätigte die verlängerte in-vitro-Stabilität der primären Leberzellen. Dies zeigte sich in der rekonstruierten Polarisierung und der messbaren Stoffwechselaktivität über längere Zeiträume. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die Kulturkonfiguration einen Einfluss auf die Aktivität der Stoffwechselwege hat. Dies sollte bei der Wahl eines geeigneten Zellkulturmodells berücksichtigt werden. Aus induzierten pluripotenten Stammzellen wurden funktionelle Leberorganoide differenziert, die Leberzell-spezifische Eigenschaften aufwiesen. Darüber hinaus bestätigen die erhobenen Daten ihre Eignung für toxikologische Langzeitstu-dien. Primäre Leberzellen bleiben zwei Wochen in erweiterten Kulturmodellen stabil. Dies ermöglicht die Untersuchung potenzieller Biomarker zur Vorhersage der DILI. Dafür wurden primäre Le-berzellmodelle langfristig mit einer Reihe von Substanzen behandelt, die bekanntermaßen DILI hervorrufen oder als sicher eingestuft wurden. Anschließend wurden sekretierte und genetisch exprimierte Biomarker untersucht. Die Studie zeigte die Eignung einiger Proteine und Gene als potenzielle Biomarker. Jedoch machten die Daten auch deutlich, dass für ein Entwicklung und Erkennung von DILI in vitro, die Integration mehrerer Leberzelltypen, einschließlich eines Im-munsystems, erforderlich ist. Die vorliegende Studie zeigte, dass erweiterte Leberzellmodelle in einer physiologischen na-hen Umgebung ein vielversprechendes Instrument zur Untersuchung der Leberbiologie, po-tenzieller DILI-Biomarker und des metabolischen und toxikologischen Profils sind. Sie können in frühe Screening-Experimente integriert werden, die in der Industrie und im akademischen Bereich eingesetzt werden. Zudem könnten sie zu einem besseren Verständnis der Arzneimit-telwirkung beitragen und die Lücke zwischen einfachen 2D- und komplexen in-vivo-Modellen schließen.

Drug discovery and development is a very time-consuming and costly process that requires many in vitro and in vivo studies. Despite numerous studies, over 90 % of drug candidates fail in preclinical or clinical trials due to insufficient safety and efficacy [1]. Drug-induced liver toxici-ty (DILI) is one of the most common cause for the high failure rate and the withdrawal of al-ready approved drugs. So far, the high loss of new drug candidates due to unpredictable hepa-totoxicity is a major problem for the pharmaceutical industry. The reason that the DILI potential of a new drug cannot be determined as early as possible is attributed to the combination of the primitive human test models in toxicological studies, the incomplete knowledge of the DILI mechanism, and the lack of sensitive, reliable biomarkers. Primary human hepatocytes cul-tured flat on an optimized plastic surface are currently the gold standard for toxicology testing, even though this model lacks important organotypic physiology and thus impaired long-term functionality. Recently, advanced cell culture models have come into focus that promise long-term toxicological testing due to the extended functionality of hepatocytes by mimicking physio-logical conditions in vitro. The aim of this thesis was to establish advanced hepatic cell culture models and evaluate new, more reliable sensitive biomarkers for DILI. The characterization of the advanced models con-firmed the extended in vitro stability and performance of primary liver cells. This was seen by reconstructed polarization, and measurable metabolic activity for extended periods. Moreover, the present results showed that culture configuration has an impact on pathway activity which should be considered when addressing a scientific issue. Functional liver organoids have been differentiated from iPSCs that exhibit liver cell-specific properties. In addition, the data confirms their suitability for long-term toxicological studies. Primary liver cells retain long-term stable in vitro. This allows the study of potential biomarkers to predict DILI events. Therefore, primary liver cell models were treated long-term with a series of compounds most and least likely to cause DILI. Subsequently, secreted and genetically ex-pressed markers were examined. The study demonstrated the suitability of some proteins and genes as potential biomarkers, but also highlighted the need of the integration of multiple liver cell types, including an immune system, to reliable develop and detect DILI in vitro. In conclusion, advanced liver models are a promising tool to evaluate potential DILI bi-omarkers, study liver biology, and metabolic and toxicologic profiles in a more physiological related environment. They can be integrated into early screening tools used in industry and academia, lead to a better understanding of drug action, and allow bridging the gap between simple 2D and complex in vivo models in the drug development process.