Funktionelle und phänotypische Analyse organständiger, residueller T-Zellkompartimente vor und nach in-vivo Depletion graft-versus-host mediierender T-Zellen

Abstract

Die Graft-versus-Host Disease (GvHD) ist eine der Hauptursachen von Therapieversagen in der hämatopoetischen Stammzelltransplantation [129-132]. Ursächlich für die Abstoßungsreaktionen sind die im Transplantat enthaltenen Lymphozyten – insbesondere CD4+-TH1-Zellen. Trotz neuer Therapieansätze wie der Entfernung naiver (CD45RA+) T-Zellen aus dem Transplantat, tritt die GvHD (wenngleich milder) weiterhin mit gleicher Frequenz auf [111-113]. In Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass das Oberflächenmolekül CD276 (B7-H3) als spezifischer Marker für alloreaktive CD4+-T-Zellen angesehen werden kann, denjenigen T-Zellen, die die GvHD initiieren und treiben [1]. Durch Co-Kultur von Spender- und Empfängerzellen und anschließender Depletion der CD276+-Fraktion konnten wir Transplantate herstellen, die keine Abstoßungs-reaktion mehr hervorrufen. Hierzu wurden die Gesamtheit der CD4+-T-Lymphozyten CD45RA- depletiert und nach MLC mit Empfängergewebe CD276-depletiert. Diese CD4+-T-Lymphozytenpopulation wurde in NSG-Ab°DR4-Mäuse transplantiert, die transgen für humanes DR4 sind. Diese Transplantate wurden sowohl von HLA-DR4-negativen als auch von HLA-DR4-positiven Spendern generiert. Durch die Depletion von CD45RA/CD276+-T-Zellen konnte die Infiltration von GvHD-Zielorganen im DR4-mismatched Setting hochsignifikant reduziert werden. Immunhistochemi-sche Untersuchungen belegen eine signifikante Reduktion der perivaskulären Infiltration. Die Analyse der „lineage“ Transkriptionsfaktoren Eomes, T-bet, GATA3, FOXP3 und RORC - indikativ für TH1-, TH2-, Treg- und TH17-Zellen – zeigte, dass TH17-Zellen nach Doppeldepletion praktisch nicht mehr vorhan-den sind. Die Identifikation der Epitop-bindenden Regionen (CDR3-Region) der T-Zellrezeptoren durch direkte Sequenzierung von Singlepeaks aus der Spectratype-Analyse erlaubte eine phänotypische Charakterisierung alloreak-tiver T-Zellrepertoires anhand ihrer CDR3-Regionen. Wir konnten innerhalb der sequenzierten alloreaktiven T-Zellrezeptoren eine große Anzahl Public-T-Zellrezeptoren zeigen sowie ein breites Repertoire an privaten virusspezifi-schen CDR3-Regionen. Identische systemische T-Zellklone traten im DR4-mismatched Setting auf, identische organspezifische T-Zellklone konnten im DR4-matched Setting identifiziert werden. Keimbahn-kodierte T-Zellrezeptoren gelten als besonders alloreaktiv und wurden nach CD45RA/CD276-Depletion nicht mehr nachgewiesen. In-vitro Analysen mit dem CD276-Antikörper zeigten eine Komplement-verstärkte ADCC, die den Antikörper für eine in-vivo Depletion alloreaktiver T-Zellen in Empfängern unmanipulierter Memory-T-Zelltransplantate geeignet machten. Die CD276 in-vivo Depletion Behandlungsgruppe zeigte zum Endpunkt der Studie an Tag 100 einen vollkommen unauffälligen Phänotyp, während die Tiere der unbehandelten Kontrollkohorte bereits spätestens an Tag 50 End-punktkriterien erreichten. Das signifikant bessere Überleben korrelierte mit den Befunden der histologischen Analyse. Es ist nun möglich, die GvHD mittels Graft Engineering ohne pharmakologische Hilfe zu kontrollieren. Diese Graft Engineering Strategie macht die haploidentische HSCT zu einer sicheren therapeutischen Option für maligne, aber auch nicht hämatologische Erkrankungen.