Characterization of CNP-induced cGMP signaling in the gastrointestinal tract and its role in colonic smooth muscle relaxation

Abstract

Hintergrund: Im Gastrointestinaltrakt (GIT) reguliert der Signalweg des cyclischen Guanosin-3‘,5‘-monophosphates (cGMP) die Wasser und Elektrolytsekretion in Epithelzellen, sowie die Relaxation der glatten Muskulatur. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass das C-Typ natriuretische Peptid (CNP), welches cGMP-Bildung durch die Guanylylzyklase B (GC-B) hervorruft, eine Glattmuskelrelaxation im Pylorus und Kolon auslöst. Weiterhin leiden Mäuse mit einer GC-B „loss-of-function“-Mutation unter einer Pylorusstenose und einem aufgeblähten Ileum, Coecum und Kolon. Jedoch sind die Zelltypen, welche diesen Glattmuskel relaxierenden Effekt von CNP sowie den Blähbauchphänotyp auslösen, noch nicht bekannt. Ziel der Arbeit: Das Ziel dieser Arbeit ist es, die CNP- und GC-B-exprimierenden Zellen im GIT zu identifizieren und die Bedeutung der CNP-induzierten cGMP Signaltransduktion für die Kolonmotilität aufzuklären. Material und Methoden: Es wurden globale GC-B Knockout (KO) Mäuse generiert, um potentielle Fehlfunktionen des GITs zu untersuchen. Die Transkription von CNP und GC-B in gastrointestinalen (GI) Segmenten wurde mittels Xgal Färbungen von lacZ Reportermäusen untersucht. Die CNP- und GC-B-transkribierenden Zelltypen wurden mithilfe von Immunfluoreszenz Doppelfärbungen identifiziert und die Expression von GC-B im Western Blot bestätigt. Die CNP-stimulierte Bildung von cGMP konnte, mithilfe von Mäusen die einen cGMP-Biosensor spezifisch in Glattmuskelzellen und Neuronen exprimieren, in vitro untersucht werden. Ferner wurden isometrische Kraftmessungen durchgeführt, um den Einfluss von CNP auf das Kontraktionsmuster von Kolonabschnitten, in der An- und Abwesenheit von Tetrodotoxin, zu untersuchen. Ergebnisse: Bei jungen GC-B KO Mäusen (<P20) wurde ein Blähbauchphänotyp beobachtet, welcher mit dem Ileum, Coecum und Kolon assoziiert war. Eine hohe Anzahl CNP transkribierender Zellen wurde im Oesophagus, Pylorus, Dünndarm und Dickdarm gefunden. GC-B transkribierende Zellen dahingegen, wurden in hoher Anzahl im Oesophagus, Pylorus, Ileum, Dickdarm und den mesenterialen Lymphknoten (MLN) gefunden. Auf Proteinebene konnte die Expression von GC-B im Oesophagus, Pylorus, Ileum, Kolon und den MLN bestätigt werden. Identifiziert wurden folgende Zelltypen: Im Dünndarm transkribierten Paneth Zellen CNP und im MLN transkribierten lymphatische Endothelzellen GC-B. Im Kolon hingegen transkribierten nitrerge Neuronen des adulten enterischen Nervensystems (ENS) beide Gene (CNP und GC-B), während Glattmuskelzellen nur GC-B transkribierten. Die durch CNP stimulierte, intrazelluläre Biosynthese von cGMP, wurde in vitro in beiden Zelltypen gezeigt. In Glattmuskelzellen wurde das dadurch gebildete cGMP durch die Phosphodiesterasen (PDE) 2A und 5 abgebaut. Dosis-Wirkungs-Kurven haben gezeigt, dass die CNP vermittelte Relaxation der glatten Muskulatur des Kolons konzentrationsabhängig ist (EC50 = 15 nM CNP). Bei Konzentrationen von ≥ 50 nM CNP zeigte die glatte Muskulatur des distalen Kolons eine stärkere Reduktion der Kontraktionsamplitude, als die glatte Muskulatur des proximalen Kolons. Interessanterweise führten 100 nM und 250 nM CNP, im distalen Kolon von Wildtyp (WT) Mäusen, zu vollständiger Relaxation der zirkularen glatten Muskulatur, währen dieselben CNP Konzentrationen im distalen Kolon von globalen GC-B KO Mäusen zu keinerlei Reaktion führten. Darüber hinaus relaxierte das distale Kolon von Neuronen-spezifischen GC-B KO Mäusen in gleichem Maße wie das distale Kolon von WT Mäusen. Der Glattmuskelzell-spezifische GC-B KO dahingegen, verhielt sich ähnlich wie der globale GC-B KO, aber signifikant verschieden vom WT. Schlussfolgerung: Im Kolon werden CNP und GC-B von nitrergen Neuronen des adulten ENS transkribiert und GC-B darüber hinaus auch von Glattmuskelzellen. Das von Glattmuskelzellen exprimierte GC-B, aber nicht das GC-B in nitrergen Neuronen, vermittelt den relaxierenden Effekt von CNP auf die zirkuläre Glattmuskelschicht des Kolons. Des Weiteren stimuliert CNP auch die Bildung von cGMP in Glattmuskelzellen des Kolons. Dieses cGMP wird von PDE2A und PDE5 abgebaut. Die Ergebnisse dieser Arbeit implizieren, dass der CNP/GC-B/cGMP Signalweg zur basalen Hemmung der zirkulären Glattmuskelschicht des distalen Kolons beiträgt.

Background: The 3’-5’ cyclic guanosine monophosphate (cGMP) signaling pathway is known to regulate gastrointestinal (GI) functions like water and electrolyte secretion of GI epithelial cells and relaxation of the GI smooth muscle layer. Guanylyl cyclase B (GC-B), which generates cGMP upon binding of the C-type natriuretic peptide (CNP), has previously been shown to mediate smooth muscle relaxation in pylorus and colon. Furthermore, GC-B loss-of-function (LOF) mutation mice have been reported to suffer from pyloric stenosis and GI obstruction in ileum, cecum, and colon. However, the cell types mediating this smooth muscle-relaxing effect of CNP and the obstruction phenotype of GC-B LOF mutation mice have not been identified yet. Aim: This study seeks to discover the cellular identity of CNP and GC-B expressing cells in the GI tract and investigates the role of CNP-induced cGMP signaling in colonic motility. Materials and Methods: Global GC-B knock-out (KO) mice were generated to investigate GI dysfunction. Whole mount Xgal staining of GI segments from lacZ reporter mice was performed to identify regions with CNP and GC-B gene transcription. Immunofluorescence double staining was used to identify the involved cell types. Western blot was used to confirm GC-B expression. The colon of mice, expressing the cGMP biosensor cGi500 in neurons or smooth muscle cells (SMCs), was used to measure cGMP generation in response to CNP. Isometric force measurements were employed to investigate colonic contraction patterns in response to CNP with and without Tetrodotoxin. Results: Young GC-B KO mice (<P20) showed a distension phenotype at the ileal-cecal-colonic region of the GI tract. A high number of CNP transcribing cells was found in esophagus, pylorus, small intestine, and large intestine. A high number of GC-B transcribing cells was found in esophagus, pylorus, ileum, large intestine, and mesenteric lymph nodes (MLN). The expression of GC-B was confirmed at the protein level in esophagus, pylorus, ileum, colon, and MLN. Regarding cell types, CNP transcription was observed in Paneth cells of the small intestine and GC-B transcription in lymphatic endothelial cells of the MLN. In colon, CNP and GC-B were both transcribed in nitrergic neurons of the mature enteric nervous system (ENS) and GC-B transcription was also found in SMCs. Colonic neurons and SMCs showed a CNP-induced elevation of intracellular cGMP levels in vitro. In CNP-stimulated SMCs, cGMP was degraded by the phosphodiesterases (PDEs) 2A and 5. Dose-response curves, assessing the colon circular smooth muscle relaxing effect of CNP, revealed an EC50 of about 15 nM CNP. The distal colon showed a stronger reduction of the contraction amplitude than the proximal colon at higher concentrations of CNP (≥ 50 nM CNP). The application of 100 nM and 250 nM CNP led to complete relaxation of the distal colon from wildtype (WT) mice, whereas the distal colon from global GC-B KO mice did not respond to CNP. Interestingly, the distal colon from neuron-specific GC-B KO mice displayed a CNP-induced smooth muscle relaxation which was not significantly different from WT. The distal colon from SMC-specific GC-B KO mice, in turn, responded similar to the global GC-B KO and significantly different from WT. Conclusion: CNP and GC-B are both transcribed by nitrergic neurons of the mature ENS in colon and GC-B is also transcribed in colonic SMCs. The GC-B that is expressed in distal colon SMCs, but not the GC-B on nitrergic neurons, leads to colonic circular smooth muscle relaxation in response to CNP. Upon CNP stimulation, colonic SMCs generate cGMP that is degraded by PDE2A and PDE5. These results imply that the CNP/GC-B/cGMP signaling pathway contributes to the tonic inhibition of the circular smooth muscle layer in distal colon.