CNP-dependent cGMP signalling in vascular smooth muscle cells: from phenotypic plasticity to atherosclerosis

Abstract

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of medium and large arteries with potentially deadly consequences. It is characterised by lesions derived from pathological remodelling of the vessel wall known as “atherosclerotic plaques”. The arterial vessel wall consists in large parts of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Contraction and relaxation of VSMCs is essential for the regulation of vascular tone and blood flow. VSMCs in healthy arteries are quiescent cells with a well-developed contractile apparatus. Upon vascular injury or during vascular diseases like atherosclerosis they switch from a contractile to a modulated phenotype. Modulated VSMCs are rich in organelles involved in protein synthesis but express only low levels of contractile proteins. This change from a contractile phenotype to a modulated one is called “phenotypic modulation” and is involved in the development of atherosclerotic plaques. Atherosclerotic plaques are characterised by subendothelial accumulation of lipids, immune cells, and modulated VSMCs. VSMCs stabilise plaques by synthesis of an extracellular matrix-rich fibrous cap but also acquire properties of other cell types (e.g., macrophages, fibroblasts) and thereby contribute to plaque growth. The second messenger 3’,5’-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) plays a pivotal role in the (patho-)physiology of VSMCs. Several types of guanylyl cyclases (GCs) generate cGMP. Nitric oxide (NO) activates the cytosolic NO-sensitive GC (NO-GC). Atrial natriuretic peptide (ANP) and C-type natriuretic peptide (CNP) activate the membrane-bound particulate GC-A and GC-B, respectively. In addition to the well-established function of cGMP to induce smooth muscle relaxation, cGMP was also reported to influence phenotypic modulation of VSMCs. For instance, it was demonstrated via genetic mouse models that cGMP signalling in VSMCs can promote atherosclerosis. During cell culture, contractile VSMCs convert towards the modulated phenotype over time. It was demonstrated that cultured VSMCs generate cGMP upon stimulation with CNP, ANP, and NO. This raises the question as to whether an individual VSMC can respond to all three stimuli or whether VSMCs change their cGMP responses due to phenotypic modulation, and, in consequence, different cells in the same population react to different stimuli. To investigate cGMP generation in cultured VSMCs, the genetically encoded Förster resonance energy transfer (FRET)-based cGMP indicator cGi500 was used in this work to perform cGMP measurements. VSMCs from transgenic mice that expressed cGi500 either globally or selectively in smooth muscle cells, were used. NO-, CNP- and ANP-induced cGMP signalling in VSMC cultures was analysed in real time with single-cell resolution in combination with immunofluorescence stainings and genetic approaches. This allowed us to draw connections between VSMC phenotypes and their cGMP response patterns. In culture, contractile VSMCs responded strongly to ANP and NO, but only weakly or not at all to CNP. Modulated VSMCs, in contrast, responded strongly to CNP but only weakly or not at all to ANP. These cells also exhibited attenuated NO-dependent cGMP responses. Furthermore, increased age of mice led to increased development of CNP-preferring VSMCs in culture. Based on these findings, we investigated whether the modulation of VSMCs in pathologically remodelled arteries influences cGMP signalling in a similar way as in cell culture. Therefore, we performed cGMP/FRET measurements in isolated arteries of cGi500 expressing mice. As model for contractile and modulated VSMCs, healthy and atherosclerotic arteries were used, respectively. In healthy vessels, cGMP increases were mainly triggered by ANP and/or NO. In atherosclerotic arteries, we could also detect prominent CNP-dependent cGMP signals. This suggests that pathological vascular remodelling in vivo leads to a similar phenotype-dependent modulation of cGMP in VSMCs as seen during cell culture. Finally, we investigated the functional relevance of CNP-dependent cGMP signalling in VSMCs for development of atherosclerosis in vivo. Genetic deletion of the CNP receptor GC-B in murine VSMCs altered the structure and composition of atherosclerotic plaques. A reporter-based approach allowed us to identify potentially CNP-responsive/modulated VSMCs (reporter-positive cells) in plaques. Silencing of CNP-dependent cGMP signalling in VSMCs led to lesions with an increased number of modulated (reporter-positive) VSMCs and a reduced α-smooth muscle actin (αSMA)-positive area in the plaque core. Altogether, these results imply that CNP-dependent cGMP signalling in VSMCs is not only a new marker for modulated VSMCs in culture as well as pathologically remodelled vessels in vivo, but also attenuates the contribution of modulated VSMCs to plaque development. Manipulation of CNP-induced cGMP signalling in plaque-associated VSMCs could be a new therapeutical approach to treat atherosclerotic disease.

Dissertation ist gesperrt bis 22.06.2024 !

Atherosklerose ist eine chronische Entzündung der mittelgroßen und großen Arterien mit potenziell tödlichem Ausgang. Sie zeichnet sich durch pathologische Umbildungen der Gefäßwände aus („atherosklerotische Plaques“). Arterielle Gefäßwände bestehen zu großen Teilen aus vaskulären Glattmuskelzellen („vascular smooth muscle cells“, VSMCs). Die Kontraktion und Relaxation von VSMCs ist unverzichtbar für die Regulation von Gefäßtonus und Blutfluss. VSMCs in gesunden Arterien sind ruhende Zellen mit einem stark ausgeprägten Kontraktionsapparat. Werden Gefäße jedoch verletzt oder unterliegen Erkrankungen wie Atherosklerose, verändern VSMCs ihren Phänotyp von einem kontraktilen zu einem modulierten Phänotyp. Modulierte VSMCs besitzen viele Organellen, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, exprimieren aber nur geringe Mengen kontraktiler Proteine. Diese Veränderung von einem kontraktilen zu einem modulierten Phänotyp wird als „phänotypische Modulation bezeichnet“ und ist an der Bildung atherosklerotischer Plaques beteiligt.

Atherosklerotische Plaques zeichnen sich durch Anreicherung von Fetten, Immunzellen und modulierten VSMCs unterhalb des Endothels aus. Zum einen stabilisieren VSMCs Plaques, indem sie eine fibrotische Kappe synthetisieren, die reich an extrazellulärer Matrix ist. Zum anderen übernehmen sie Charakteristika anderer Zelltypen (z.B.: Makrophagen, Fibroblasten) und tragen zum Wachstum von Plaques bei. Der sekundäre Botenstoff zyklisches Guanosin-3‘,5‘-Monophosphat (cGMP) spielt eine zentrale Rolle in der (Patho-)Physiologie von VSMCs. Es gibt mehrere Guanylylzyklasen (GCs), die cGMP generieren. NO aktiviert die zytosolische NO-sensitive GC (NO-GC). Atriales natriuretisches Peptid (ANP) und C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) hingegen aktivieren membran-gebundene partikuläre GCs. ANP aktiviert GC-A und CNP GC-B. Neben der allgemein anerkannten Funktion von cGMP Glattmuskelzellen zu relaxieren, ist auch beschrieben, dass es die phänotypische Modulation von VSMCs beeinflussen kann. Zum Beispiel wurde mit Hilfe genetisch veränderter Mäuse gezeigt, dass die cGMP-Signalgebung in VSMCs Atherosklerose fördern kann. Es ist bekannt, dass VSMCs in Zellkultur mit der Zeit vom kontraktilen zum modulierten Phänotyp wechseln. In Zellkultur wurde gezeigt, dass VSMCs cGMP erzeugen, wenn sie mit CNP, ANP oder NO stimuliert werden. Das führt zu der Frage, ob dieselbe Glattmuskelzelle auf alle drei Stimuli reagieren kann oder ob sich die cGMP-Antworten einzelner VSMCs aufgrund phänotypischer Modulation verändern und verschiedene Zellen in derselben Kultur schließlich auf verschiedene Stimuli reagieren.

Um die Erzeugung von cGMP in kultivierten VSMCs zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe des genetisch kodierten Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierten cGMP-Indikators cGi500 cGMP Messungen durchgeführt. Es wurden VSMCs aus transgenen Mäusen verwendet, die cGi500 entweder global oder selektiv in Glattmuskelzellen exprimieren. NO-, CNP- und ANP-induzierte cGMP Signale wurden in VSMC-Kulturen in Echtzeit mit Einzelzellauflösung gemessen und in Kombination mit Immunfluoreszenzfärbungen und genetischen Ansätzen analysiert. Dadurch konnten wir eine Verbindung zwischen dem Phänotyp von VSMCs und ihren cGMP-Reaktionsmustern aufzeigen. In Kultur haben kontraktile VSMCs stark auf ANP und NO, jedoch nur schwach oder gar nicht auf CNP reagiert. Modulierte VSMCs hingegen haben stark auf CNP, jedoch nur schwach oder gar nicht auf ANP reagiert. Auch die NO-abhängigen cGMP-Antworten waren in diesen Zellen abgeschwächt. Des Weiteren hat ein erhöhtes Alter der Mäuse zu vermehrter Bildung CNP-präferierender VSMCs in Kultur geführt.

Auf Grundlage dieser Entdeckungen haben wir untersucht, ob die Modulation von VSMCs in pathologisch veränderten Arterien die cGMP-Signalgebung auf ähnliche Weise beeinflusst wie in der Zellkultur. Dazu wurden cGMP/FRET-Messungen in isolierten Gefäßen von cGi500-exprimierenden Mäusen durchgeführt. Als Modell für kontraktile bzw. modulierte VSMCs wurden gesunde bzw. atherosklerotische Arterien untersucht. In gesunden Gefäßen wurde die Bildung von cGMP vor allem durch ANP und/oder NO ausgelöst. In atherosklerotischen Arterien wurden zusätzlich deutliche CNP-abhängige cGMP-Signale detektiert. Dies deutet darauf hin, dass sich die cGMP-Erzeugung bei pathologischen Gefäßumbildungen in vivo, ähnlich wie in Zellkultur, abhängig vom VSMC-Phänotyp ändert.

Schließlich haben wir die funktionelle Bedeutung der CNP-abhängigen cGMP-Signalgebung in modulierten VSMCs für die Entwicklung von Atherosklerose in vivo untersucht. Die genetische Deletion des CNP-Rezeptors GC-B in VSMCs von Mäusen hat die Struktur und Zusammensetzung der atherosklerotischen Plaques verändert. Mit Hilfe eines Reporter-basierten Ansatzes haben wir potenziell CNP-reaktive/modulierte VSMCs (Reporter-positive Zellen) in Plaques nachgewiesen. Das Ausschalten von CNP-abhängiger cGMP-Signalgebung in VSMCs hat zu Läsionen geführt, die mit modulierten (Reporter-positiven) Zellen angereichert waren und deren Kernregion eine verringerte α-Glattmuskelaktin (αSMA)-positive Fläche aufwies.

Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die CNP-abhängige cGMP-Signalgebung in VSMCs nicht nur ein neuer Marker für modulierte VSMCs in Kultur, als auch pathologisch veränderten Gefäßen in vivo ist, sondern auch den Beitrag von modulierten VSMCs zur Plaque-Entwicklung einschränkt. Die gezielte Manipulation der CNP-induzierten cGMP-Signalgebung in Plaque-assoziierten VSMCs könnte ein neuer Ansatz zur Therapie atherosklerotischer Erkrankungen sein.