Optimierung einer multiplex, quantitativen real-time PCR zur Detektion von hrp2- und hrp3-Gendeletionen bei Plasmodium falciparum

Abstract

Malaria ist eine der global bedeutendsten Infektionskrankheiten. Als Goldstandard zum Nachweis einer Malariainfektion gilt die Mikroskopie. Diese Methode birgt Probleme durch den nicht flächendeckenden Zugang zu Elektrizität vor allem in den Hauptendemiegebieten der Erkrankung und aufgrund der großen Expertise, die für das richtige Erkennen der Infektionen bei dieser Diagnostikmethode vorausgesetzt wird. Im letzten Jahrzehnt konnte durch die Einführung von Schnelltests die Rate von Personen, die auf Malaria getestet werden, entscheidend erhöht und damit auch die Behandlung dieser Personen ermöglicht werden. Nach Einführung und breiter Nutzung dieser Schnelltests wurden in mehreren Studien falsch-negative Testergebnisse beschrieben. Als Gründe werden zu niedrige Parasitämien und Schnelltests geringer Qualität genannt, bis hin zu Parasitenstämmen, die das nachzuweisende Protein HRP2 nicht mehr exprimieren. Die WHO hat daraufhin empfohlen, die Prävalenzen der hrp2- und hrp3-Gendeletionen zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeitsgruppe wurde dazu ein 4plex-qPCR-Protokoll entwickelt, welches in einem einzigen Schritt eine Aussage über das Vorhandensein der Gene hrp2 und hrp3 trifft, gleichzeitig durch das Gen cytochrom b hochsensitiv eine Infektion mit dem P. falciparum nachweist und durch das single copy gene β tubulin eine interne Qualitätskontrolle ermöglicht. Bei dem ersten 4plex-qPCR_v1-Protokoll wurde von einer relativ hohen Rate an Kreuzreaktivität zwischen hrp2 und hrp3 ausgegangen, weshalb für die vorliegende Arbeit neue Primer und Sonden de-signt wurden und ein 4plex-qPCR-Protokoll der zweiten Generation etabliert und optimiert wurde. Mit diesem Protokoll wurden klinische Feldproben aus Lambaréné, Gabun, gemessen, die in vorherigen Messungen mit dem 4plex-qPCR_v1-Protokoll unklare Ergebnisse erbracht haben. Weiter konnte gezeigt werden, dass die Sensitivität des Nachweises einer hrp2- bzw. hrp3-Deletion mit dem 4plex-qPCR_v2-Protokoll entscheidend höher liegt als die Sensitivität, die mit der konventionellen PCR zu erreichen ist. Für weitere epidemiologische Studien zur Prävalenzbestimmung der Deletionen empfiehlt sich daher die Me-thode der qPCR. Das 4plex-qPCR_v2-Protokoll wird von nun an innerhalb dieser Arbeitsgruppe für die weitere Detektion von hrp2- und hrp3-Deletionen in Lambaréné, Gabun, verwendet.