Die Interaktion von 14-3-3 Proteinen mit NON-PHOTOTROPIC HYPOCOTYL 3: Untersuchungen zur Komplexbildung und funktionellen Bedeutung

Abstract

Das Plasmamembran-assoziierte Protein NPH3 (NON-PHOTOTROPIC HYPOCOTYL 3) ist essentiell für die phototrope Reaktion. Der molekulare Mechanismus der Membran-Rekrutierung des hydrophilen NPH3-Proteins war lange Zeit ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen 51 Aminosäuren von NPH3 direkt an polyacide Phospholipide binden. In dieser Region wurden zwei Motive identifiziert, die durch elektrostatische als auch hydrophobe Interaktionen die Assoziation von NPH3 an die Plasmamembran bedingen. NPH3 wurde als putativer Interaktionspartner von sogenannten 14-3-3-Proteinen identifiziert. Letztere interagieren sequenzspezifisch und phosphorylierungsabhängig mit einer Vielzahl von Polypeptiden und modulieren deren Aktivitätsstatus. Pflanzliche 14-3-3 tragen zur polaren Lokalisierung von Auxin-Efflux-Carriern – sogenannten PIN-Proteinen – bei und könnten demnach durch Regulation von NPH3 für den veränderten Transport von Auxin während der phototropen Reaktion verantwortlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte sowohl die NPH3:14-3-3-Komplexbildung als auch das NPH3-Bindemotiv (S744) verifiziert werden. Es konnte auch gezeigt werden, dass die NPH3:14-3-3-Interaktion ausschließlich im Blaulicht und nicht in Dunkelheit stattfindet. Darüber hinaus scheint die Licht-induzierte 14-3-3-Bindung eine substantielle Konformationsänderung u. a. der amphipathischen Helix zur Folge zu haben, die eine Einbettung in die Membran unterbindet. Ebenfalls ergab sich der wesentliche Hinweis, dass die 14-3-3-vermittelte Plasmamembran-Dissoziation von NPH3 für die phototrope Reaktivität von Bedeutung ist. Zudem ist dieser Lichtinduzierte Prozess in Dunkelheit reversibel. Aufgrund detaillierte Analysen von weiterer transgener nph3-loss-of-function-Linien, die unterschiedliche GFP:NPH3-Varianten exprimieren, ermöglichte die Entwicklung eines neuartigen Modells zur phototropen Reaktivität von NPH3. Demzufolge ist die durch (Blau-)Licht regulierte Zirkulation von NPH3 essentiell für die Funktion. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Blaulicht-abhängigen Modifikationen des Phosphorylierungsstatus von NPH3, welche hoch komplex sind. Somit wurden Experimente zur direkten Identifizierung von in vivo-Phosphorylierungsstellen in NPH3 und ihre Modifikation durch das Lichtregime durchgeführt. Die statistisch noch nicht signifikanten Ergebnisse verweisen auf eine größere Bedeutung von Licht-induzierten Phosphorylierungen als bisher angenommen.