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In einer alternden Gesellschaft mit zunehmenden negativen Einflüssen auf den Knochenstoffwechsel wächst die Bedeutung eines ständig verfügbaren, sowie ethisch vertretbaren Knochenstoffwechselmodells. Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit ein in vitro Modell zu entwickeln, das den menschlichen Knochenstoffwechsel mit Osteoblasten und Osteoklasten sowie deren Interaktion widerspiegelt. Experimentelle Vorversuche und Versuche zur Expression spezifischer Proteine zeigten die Eignung der humanen Zelllinien SaOS-2 und THP-1. Die Entwicklung der Co-Kultur ergab ein optimales Zell-Zell-Verhältnis von 2:1 - THP-1 Zellen: SaOS-2 Zellen. Die Differenzierung unter 2 % FCS führte zu einer verbesserten Stoffwechselaktivität und einer Stabilität des Modells von bis zu 14 Tagen. Erste Untersuchungen wiesen die Notwendigkeit einer Zell-Normalisierung zur Evaluation der Messdaten auf. Versuche die beiden Zellarten separat voneinander mittels Zellfärbung bzw. Transfektion mit spezifischen Markern zu quantifizieren, erwiesen sich als ungeeignet. Über geschlechtsspezifische Chromosomen konnten mittels PCR die Zellarten separat quantifiziert werden. Zur Überprüfung der Zell-Zell-Interaktion wurde der Einfluss von Bisphosphonaten (Alendronat, Zoledronat) untersucht. Es bestätigte sich die erwartete Hemmung der Osteoklasten, sowie die angestrebte Interaktion von SaOS-2 und THP-1 Zellen. Jedoch zeigte sich auch eine Beeinflussung der SaOS-2 Zellen durch die Bisphosphonate. Die Beobachtungen werden von Ergebnissen der Literatur unterstützt [177,178]. Parallel durchgeführte Versuche mit SaOS-2 und THP-1 Zellen in Mono-Kultur zeigten abweichende Ergebnisse. Dies hob die Bedeutung des Co-Kultur-Modells für zukünftige Untersuchungen hervor. Untersuchungen über den Einfluss von Metformin auf das Co-Kultur Modell zeigten keine Toxizität von Metformin, sondern eine vermehrte Proliferation der SaOS-2 Zellen sowie Hinweise auf eine Hemmung der osteogenen Differenzierung trotz konstanter Matrixmineralisierung. THP-1 Zellen wiesen bei höheren Metformin-Konzentrationen eine reduzierte osteoklastäre Aktivität auf. Um die in vitro Kultivierungsbedingungen den in vivo Gegebenheiten weiter anzugleichen, wurde die in 2D kultivierte Co-Kultur auf eine 3D-Matrix transferiert. Auch die 3D-Matrix sollte möglichst kostengünstig und einfach herzustellen und ständig verfügbar sein. Die Vielfalt möglicher Inhaltsstoffe, Flexibilität der Parameter und ein einfacher Herstellungsprozess unterstützten die Entwicklung einer 3D-Matrix auf Basis von Cryo-Gelen. Eine Anpassung des Verhältnisses von pHEMA und BAA steigerte die Steifigkeit der Matrix. Eine Optimierung des Herstellungsprozesses vergrößerte die Porenweite, erhöhte somit die Steifigkeit, Permeabilität und Reproduzierbarkeit der Matrix. Die Zugabe von humanen Plasmalysat steigerte die Zell-Adhärenz und durch externe Kristallisation mit Kalziumchlorid und einem Phosphatpuffer statt direkter Zugabe von Hydroxylapatit optimierte Porendurchmesser und Steifigkeit weiter. Als abschließender Schritt wurde die Co-Kultur auf die entwickelte 3D-Matrix transferiert und der Einfluss diabetischer Bedingungen (mit/ohne Metformin) untersucht. Die Wahl fiel auf DM Typ II, da Patienten mit DM Typ II oftmals Wund- und Knochenheilungsstörungen aufweisen [31]. Mit einer stetig steigenden Inzidenz von DM Typ II gewinnt dies an Relevanz für die Unfallchirurgie. DM Typ II-Patienten weisen trotz erhöhter Knochendichte eine verringerte Knochensteifigkeit und somit ein erhöhtes Frakturrisiko auf [197,198]. Dieser Effekt konnte bisher in 2D Mono-Kultur Versuchen nicht nachgewiesen werden. Osteoblasten und Osteoklasten zeigten unter 2D Hyperglykämie und Hyperinsulinämie und deren Kombination eine reduzierte spezifische Aktivität auf. So konnte trotz Verwendung einer Co-Kultur eine erhöhte Knochendichte bei DM Typ II im Modell nicht nachgewiesen werden. Dies weist auf komplexere Zusammenhänge jenseits der einfachen Zell-Zell-Interaktion hin. Diese sollen mit Hilfe einer 3D-Umgebung, die realistischer die Knochenstruktur abbildet, weiter untersucht werden. Die Co-Kultur wurde parallel unter den gleichen Bedingungen in 2D und 3D differenziert. Dabei zeigten sich Unterschiede in der mitochondrialen-Aktivität (2D: erhöht, 3D: reduziert) und DNA-Gehalt (2D: rückläufig, 3D: konstant). Das Zell-Zell-Verhältnis verschob sich unter 2D zugunsten der Osteoklasten, blieb jedoch in 3D konstant. Somit zeigte sich ein positiver Einfluss der 3D Matrix auf Viabilität und Stabilität, wie auch eine Beeinflussung des Zell-Metabolismus, das sich mit der aktuellen Literatur deckt [75,76]. Der Einfluss diabetischer Bedingungen unter 3D führte zu Veränderungen der Osteoblasten- und Osteoklastenaktivität, die mit vermehrter Matrix-Mineralisierung bei reduzierter Steifigkeit einhergehen. Somit konnte im 3D Co-Kultur Modell der Einfluss von DM Typ II auf den Knochen in vitro nachgebildet werden. Auch zeigten sich Hinweise, dass Metformin dem Einfluss von Hyperglykämie und Hyperinsulinämie entgegenwirkt, was sich im 3D Modell ausgeprägter zeigte. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen die Notwendigkeit einer direkten Co-Kultur und Bedeutung einer 3D-Umgebung. Das hier entwickelte Modell eröffnet die Grundlage Knochenpathologien sowie den Einfluss von Umwelteinflüssen und Medikamenten auf den Knochenstoffwechsel sowie neue Therapieansätze in vitro zu erforschen [21]. |
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