Inhaltszusammenfassung:
Etwa ein Viertel aller humanpathogenen genetischen Varianten stehen im Zusammenhang mit einer G-zu-A Punktmutation und insbesondere RNA spezifische Adenosin-Desaminasen (ADARs) boten eine vielversprechende Möglichkeit, die fehlerhaften Informationen auf RNA Ebene zu korrigieren. Da Inosin biochemisch als Guanosin interpretiert wird, entwickelte sich daraus die zielgerichtete A-nach-I Editierung, als vorteilhafte und posttranskriptionelle Modifikation, welche weitreichende Konsequenzen für die RNA und deren Funktion mit sich bringt. Da ADARs hochselektiv an doppelsträngige RNA binden, werden zur Hybridisierung mit der Ziel mRNA so genannte gRNAs verwendet. Neben der viralen Transduktion werden für diese heutzutage in Zellkulturversuchen jedoch immer noch zelltoxische Transfektionsreagenzien als häufigstes Transportmittel verwendet. Daher was es das Ziel dieser Doktorarbeit, die Vorteile einer rezeptorgesteuerten Endozytose anderer RNA Therapeutika auf zwei unterschiedliche Editierungssysteme zu übertragen: Auf das SNAP®-ADAR System, welches ein künstliches Desaminase Fusionsprotein verwendet, sowie auf das RESTORE System, welches in der Lage ist endogenes ADAR zu rekrutieren. Insbesondere der Asialoglycoproteinrezeptor (ASGPR) und sein synthetischer, dreiarmiger N-Acetylgalaktosaminligand (GalNAc), sollten sich dafür eignen, um das generelle Repertoire der zielgerichteten RNA Editierung zu erweitern und deren Potential als zukünftiges Therapeutikum zu steigern. Mit diesem Ziel wurde eine neue und nasschemische Methode etabliert, um Disulfid terminale gRNAs an ein zuvor synthetisiertes GalNAc-Maleimidderivat zu konjugieren. Zusätzlich wurde die Anwendbarkeit von GalNAc konjugierten gRNAs in entsprechenden und eigens dafür erstellten Ziellinien demonstriert. Durch die Anwendung fluoreszenzbildgebender Methoden, sowie der Verwendung von Chloroquin, welches einen destabilisierenden Effekt auf Endosomen aufweist, wurde jedoch klar, dass zwar eine ausreichende Menge an gRNAs mittels der rezeptorgesteuerten Endozytose in die Zellen transportiert wurde, diese jedoch weder im Zytoplasma noch im Zellkern zur Verfügung stand. Des Weiteren wurden unter der Verwendung von Chloroquin und der rezeptorgesteuerten Aufnahme einer RESTORE v2 gRNA, sowie einer niedrigen gRNA Konzentration (0.2 μM), Editierungsausbeuten von bis zu 51 % in der kodierenden Sequenz eines endogenen Transkripts (GAPDH) erzielt. In diesem Zusammenhang und wegen der geringeren lysosomalen Stabilität der verwendeten gRNAs, wurde ein endosomaler Einschluss und die damit verbundene, begrenzte endosomale Freisetzung der gRNAs als limitierender Faktor für zukünftige Anwendungen herausgearbeitet. Darüber hinaus boten die noch nicht vollständig charakterisierte, aber nicht zu vernachlässigende gymnotische Aufnahme, sowie die rezeptorgesteuerte Endozytose von unkonjugierten, aber Phosphorothioat modifizierten Oligonukleotiden, erhebliche und konkurrierende Transportwege in die Zelle. Nichts desto trotz bietet der rezeptorgesteuerte Transport von GalNAc konjugierten gRNAs in ASGPR exprimierende Zellen eine vielversprechende Möglichkeit, um die Verwendung zelltoxischer Transfektionsreagenzien zu vermeiden. Des Weiteren und insbesondere für die Verwendung des RESTORE Systems, ist es ein weiterer Schritt in Richtung einer in vivo Anwendung und dadurch einer potenziellen und zukünftigen Applikation als weiteres RNA Therapeutikum.
Abstract:
About a quarter of all human pathogenic genetic variants are related to a G-to-A single nucleotide polymorphism. As a consequence, the deamination of adenosines by adenosine deaminases that act on RNA (ADARs) provides a promising approach to recode the incorrect genetic information on the RNA level. Because of the biochemical interpretation of inosine as guanosine, site-directed RNA editing arose as a highly promising post-transcriptional modification to introduce wide-ranging consequences in RNA function by A-to-I base substitutions. While ADARs are highly selective on double-stranded RNAs, so-called gRNAs are applied to hybridize with the target site mRNA and to form the necessary dsRNAs. However, besides viral transductions, especially cell toxic transfection reagents are nowadays most commonly used within cell culture approaches to internalize gRNAs, which are mandatory for the hybridization with the target mRNA and the formation of double-stranded RNA. For this reason, it is the aim of this doctoral thesis to transfer the advantages of a receptor mediated endocytosis of other RNA targeting therapeutic applications to two different RNA editing systems: The SNAP®-ADAR system, using an artificial deaminase fusion protein, and the RESTORE system, recruiting endogenous ADAR. Especially the asialoglycoprotein receptor (ASGPR) and its synthetic triantennary N-acetyl galactosamine ligand (GalNAc) were thought to add to the toolbox of site-directed editing systems and their potential in future therapeutic applications. Therefore, a novel wet chemical synthetic route was established to modify disulfide terminal gRNAs with a prior synthesized GalNAc-maleimide derivative. For each editing system the applicability of GalNAc modified gRNAs was demonstrated in appropriate and specifically engineered cell lines. Due to the application of fluorescence imaging, as well as Chloroquine as an additive with endosomal disruptive properties, it was possible to conclude that a sufficient amount of gRNA was internalized by the receptor mediated endocytosis but did not become available within the cytoplasm or the nucleus. Using Chloroquine, it was possible to obtain editing yields up to 51 % in the open reading frame (ORF) of an endogenous transcript (GAPDH) utilizing the receptor mediated endocytosis of RESTORE v2 gRNAs and low gRNA concentrations of 0.2 μM. In this context, and regarding the reduced lysosomal stability of the used gRNAs, an endosomal entrapment and the limited endosomal release of gRNAs was elaborated as major bottleneck for future applications. In addition, the still uncharacterized, but not negligible gymnotic uptake or receptor mediated endocytosis of unconjugated phosphorothioate (PS) oligonucleotides provided still highly competing pathways for the targeted delivery. However, the receptor mediated delivery of GalNAc conjugated gRNAs into ASGPR expressing cells is providing a promising technique to prevent the necessity of cell toxic transfections reagents, and especially for the use of the RESTORE system, another step towards in vivo approaches and a potential future therapeutic application was made.
