The multi-span mitochondrial outer membrane protein Om14 follows different biogenesis pathways

Abstract

Mitochondrien sind wichtige eukaryontische Organellen für die Energieerzeugung sowie für verschiedene zelluläre Aktivitäten. Eine Funktionsstörung der Mitochondrien steht in engem Zusammenhang mit dem Zelltod und kann beim Menschen zu schweren Krankheiten wie neurologischen Entwicklungsstörungen und Stoffwechselstörungen führen. Die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen mitochondrialen Funktion wird durch Proteine aus verschiedenen mitochondrialen Subkompartimenten gewährleistet. Proteine, die sich in der mitochondrialen Außenmembranen (MAM) befinden und mehrere Transmembrandomänen aufweisen, werden als „multispan“-Proteine bezeichnet. Zahlreiche Forschungsarbeiten haben versucht, die Biogenese von Multispan MAM-Proteinen zu verstehen. Es wird angenommen, dass die neu synthetisierten MAM Vorläuferproteine vom Rezeptor Tom70 auf der Oberfläche der Mitochondrien erkannt werden. Der genaue Beitrag von Tom70 zu diesem Prozess ist jedoch nur unzureichend bekannt. In dieser Studie habe ich die Rolle, die die zytosolische Domäne von Tom70 bei der Erkennung verschiedener Substrate spielt untersucht. Hierbei konnte ich nachweisen, dass Tom70 direkt mit Multispan MAM-Proteinen interagieren kann und auch als Andockstelle für an Vorläufer-gebundene Chaperone fungiert. Nach der Erkennung werden die Multispan Vorläufer der Außenmembran an den MIM-Komplex weitergeleitet, der ihre Integration in die Außenmembran weiter erleichtert. Dennoch ist wenig über das Zielsignal innerhalb solcher Substrate und die Beteiligung anderer potenzieller Faktoren an ihrer Biogenese bekannt. Eine andere Theorie besagt, dass die Integration von Multispan MAMProteinen nur durch Lipide reguliert wird und spontan ohne die Hilfe von Importfaktoren erfolgen kann. In meiner Studie habe ich versucht, diese Diskrepanz auszugleichen und die Biogenese dieser Proteine anhand des Multispan Hefe MAM-Proteins Om14 als Modellprotein zu erforschen. Ich habe zunächst das Targeting-Verhalten verschiedener Trunkierungsvarianten untersucht und dabei herausgefunden, dass mehrere Targeting-Signale gemeinsam zu einer perfekten mitochondrialen Targeting-Spezifität beitragen. Als Nächstes habe ich einen spezifischen Importtest durchgeführt, um die Auswirkungen verschiedener Elemente auf die Insertionseffizienz von Om14 zu testen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass keine der zytosolisch ex-ponierten Domänen der Proteinös-Faktoren für den Om14-Biogeneseprozess wesentlich ist. Gleichzeitig wurde nachgewiesen, dass Mim1 und Porin beide an der optimalen Membranintegration von Om14 beteiligt sind. Darüber hinaus analysierte ich den Einfluss der Entfaltung von neu synthetisiertem Om14, der Hydrophobizität seiner Transmembransegmente und einer erhöhten Membranfluidität auf die Effizienz seiner Membranintegration. Ich beobachtete, dass die Entfaltung des Substratproteins und eine erhöhte Temperatur die Importeffizienz von Om14 erhöhten, während eine verringerte Hydrophobizität des zweiten Transmembransegments diese reduzierte. Insgesamt bieten meine Ergebnisse einen neuen Einblick in die Biogenese des Multispan MAM-Proteins Om14 und deuten auf die Koexistenz zahlreicher alternativer Wege hin, bei denen sowohl proteinhaltige Faktoren als auch das Membranverhalten in unterschiedlichem Maße zur kombinierten Insertionseffizienz beitragen.

Mitochondria are essential eukaryotic organelles for energy production as well as various cellular activities. Dysfunction of mitochondria is closely related to cell death and can result in severe human diseases such as neurodevelopmental and metabolic disorders. The maintenance of proper mitochondrial function is achieved by proteins located in different mitochondrial sub-compartments. Proteins embedded in the outer mitochondrial membranes (OMM) with several transmembrane segments are defined as multi-span proteins and considerable efforts have been made to understand their biogenesis. Newly synthesized precursors of these proteins are believed to be recognized by the receptor Tom70 on the surface of mitochondria. However, the precise contribution of Tom70 to this process is poorly understood. In this study, I analyzed the involvement of the Tom70 cytosolic domain in the recognition of different substrates. I found that Tom70 could directly interact with multi-span OMM proteins as well as function as a docking site for precursor-bound chaperones. The relative importance of the two functions of Tom70 varies from substrate to substrate. After the initial recognition, multi-span outer membrane precursor proteins are passed on to the MIM complex which further facilitate their integration into the outer membrane. Nevertheless, little is known about the targeting signal within such substrates and the involvement of other potential factors in their biogenesis. Interestingly, another theory suggested that the integration of multi-span OMM proteins is only lipid-regulated and can occur spontaneously without the help of any import factors. In my study, I tried to reconcile this apparent discrepancy and obtain a deep knowledge of the biogenesis of these proteins using the yeast multi-span OMM protein Om14 as a model protein. I first examined the targeting behavior of different truncation variants and found out that multiple targeting signals collectively contributes to the perfect mitochondrial targeting specificity. Next, I employed a specific import assay to test the effect of different elements on the insertion efficiency of Om14. The results suggest that none of the cytosolic exposed domain of proteinaceous factors is essential for the Om14 biogenesis process. In contrast, I could demonstrate that both Mim1 and Porin are involved in the optimal membrane integration of Om14. In addition, I analyzed the influence of the unfolding of newly synthesized Om14, the hydrophobicity of its transmembrane segments, and an increased membrane fluidity on the efficiency of its membrane integration. I observed that unfolding of the substrate protein and elevated temperature increased the import efficiency of Om14 whereas reduced hydrophobicity of the second transmembrane segment decreased it. Collectively, my results provide a novel insight into the biogenesis of the multi-span OMM protein Om14, suggesting the coexistence of many alternative routes in which both proteinaceous factors and membrane behavior contribute to varying degrees to the combined insertion efficiency.