Development of enzyme-specific chemical probes for high-throughput substrate profiling of histone deacetylases

Abstract

Histone deacetylases (HDACs) are responsible for the deacetylation of Nε-acetyllysine residues of histones and non-histone proteins via zinc-dependent Lewis-acid catalysis. By modulating the acetylation status of chromatin, HDACs regulate diverse cellular functions on the level of transcriptional control. Aberrant HDAC activiy is associated with a variety of diseases such as cancer and neurodegenerative disorders. Consequently, HDAC inhibitors have been developed in order to treat these diseases. However, advancements in inhibitor specificity require detailed knowledge about HDAC substrate selectivity. Substrate selectivity of endogenous HDAC complexes can be investigated with affinity probes that contain an inhibitory moiety embedded into synthetic peptides derived from known acetylation sites.

In this work, strategies to create new, enzyme-specific peptide-based affinity probes for HDACs were developed. To this end, the influence of different zinc-binding functional groups and peptide sequence contexts on the recruitment of HDACs was investigated.

Based on the structure of hydroxamic acid-, 2-aminophenylamide- and ketone-type HDAC inhibitors, synthetic routes for protected amino acid building blocks that contain these moieties as zinc-binding groups were devised. Incorporation of the respective building blocks into peptide probes with minimal sequence context furnished new tools to capture endogenous HDACs from cellular lysates. Applied in pulldown assays, the 2-aminophenylamide probe showed a distinct selectivity for class I HDACs 1, 2 and 3, when compared to control probes containing either the broad-specificity hydroxamic acid or an unmodified lysine residue. Compared to the hydroxamic acid probe, the ketone-based probe was able to enrich class I HDAC1 more efficiently over the lysine control than class II HDAC6. The experiments were then extended to a proteome-wide level by analyzing the interactomes of selected probes. Compared to the hydroxamic acid control, components of the HDAC3 NCoR/SMRT complex were significantly enriched on the 2-aminophenylamide probe, demonstrating the ability of peptide-based affinity probes to address specific HDAC complexes.

The design of HDAC affinity probes was then optimized with regard to high-throughput approaches, which are required to investigate HDAC substrate selectivity on a proteome-wide scale. To this end, a high-throughput assay based on the format of 96-well plates was developed. A probe design was devised that uses an N-terminal thiol anchoring moiety to selectively capture full-length probes from crude product mixtures, bypassing time-consuming peptide purification. The new 96-well assay was then applied to assess the influence of peptide sequence contexts on HDAC selectivity by screening potential substrate sites of HDAC6 identified in cells with impaired HDAC6 activity. A majority of the tested sequences were able to enrich HDAC6 on hydroxamic acid-containing probes over the lysine controls, while HDAC1 was unspecifically or only weakly recruited. Selected sequence context probes were analyzed in-depth by MS-based proteomics, uncovering a distinct interaction profile of each sequence context with potential HDAC6 binding partners from diverse biological pathways, such as transcription factors, cytoskeletal proteins or components of the ubiquitin-proteasome system. Finally, a MALDI-MS-based kinetic assay with acetyllysine substrates revealed subtle differences in HDAC6-catalyzed deacetylation velocities depending on the individual peptide sequence.

Dissertation ist gesperrt bis 29.03.2024 !

Histondeacetylasen (HDACs) sind verantwortlich für die Deacetylierung von Nε-Acetyllysinresten von Histonen und Nicht-Histonproteinen mittels zinkabhängiger Lewis-Säurekatalyse. Indem sie den Acetylierungsstatus des Chromatins beeinflussen, regulieren HDACs eine Vielzahl zellulärer Funktionen auf der Ebene der Transkriptionskontrolle. Veränderungen der HDAC-Aktivität werden mit Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Um diese Krankheiten zu behandeln wurden HDAC-Inhibitoren entwickelt. Für eine Verbesserung der Spezifität von HDAC-Inhibitoren ist jedoch ein detailliertes Verständnis der Substratselektivität von HDACs erforderlich. Die Substratselektivität endogener HDAC-Komplexe kann mit Affinitätssonden untersucht werden, die eine Inhibitoreinheit enthalten, welche in synthetische Peptide engebettet ist, die sich von bekannten Acetylierungsstellen von Substratproteinen ableiten. In dieser Arbeit wurden Strategien entwickelt um neue und spezifische peptidbasierte Affinitätssonden für HDACs zu etablieren. Zu diesem Zweck wurde der Einfluss verschiedener zinkbindender funktioneller Gruppen und Peptidsequenzkontexte auf die Rekrutierung von HDACs untersucht. Basierend auf Hydroxamsäure-, 2-Aminophenylamid- und Keton-HDAC-Inhibitoren wurden Syntheserouten für geschützte Aminosäurebausteine entworfen, die diese Strukturelemente als zinkbindende Gruppen enthalten. Durch das Einbetten der jeweiligen Bausteine in Peptidsonden mit einem minimalen Sequenzkontext wurden neue Werkzeuge geschaffen um endogene HDACs aus zellulären Lysaten zu isolieren. Verglichen mit Kontrollsonden, die entweder eine Hydroxamsäure mit breiter Spezifität oder unmodifiziertes Lysin enthielten, zeigte die 2-Aminophenylamid-Sonde in Pulldown-Experimenten eine ausgeprägte Selektivität für die Klasse-I-HDACs 1, 2 und 3. Die Keton-Sonde konnte im Vergleich zur Hydroxamsäure-Sonde HDAC1 der Klasse I effektiver gegenüber der Lysin-Kontrolle anreichern als HDAC6 der Klasse II. Die Untersuchungen wurden dann auf eine proteomweite Ebene ausgedehnt und die Interaktome ausgewählter Sonden bestimmt. Gegenüber der Hydroxamsäure-Kontrolle konnte dabei der HDAC3-NCoR /SMRT-Komplex an der 2-Aminopheylamid-Sonde signifikant angereichert werden, was die Fähigkeit peptidbasierter Affinitätssonden aufzeigt HDAC-Komplexe spezifisch adressieren zu können. Das Design der HDAC-Affinitätssonden wurde anschließend im Hinblick auf Hochdurchsatzverfahren optimiert, die notwendig sind, um die Substratspezifität von HDACs in einem proteomweiten Umfang zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde ein Hochdurchsatz-Assay entwickelt, der auf dem Format von 96-Well-Platten basiert. Ein Sondendesign wurde entworfen, das es ermöglicht vollständig synthetisierte Peptide selektiv aus einem rohen Produktgemisch mittels eines N-terminalen Thiol-Ankers zu isolieren und somit eine zeitaufwendige Reinigung zu umgehen. Der neu entwickelte 96-Well-Assay wurde dann angewendet, um den Einfluss von Peptidsequenzkontexten auf die Selektivität von HDACs zu bewerten. Dazu wurden potentielle Substrate von HDAC6 untersucht, die in Zellen mit verminderter HDAC6-Aktivität identifiziert wurden. Die Mehrheit der getesteten Sequenzen war dabei in der Lage HDAC6 an den entsprechenden Hydroxamsäure-Sonden gegenüber den Lysin-Kontrollen anzureichern, während HDAC1 unspezifisch oder nur schwach rekrutiert wurde. Ausgewählte Sequenzkontextsonden wurden im Detail mittels MS-gestützter Proteomik charakterisiert, was es ermöglichte spezifische Interaktionsprofile der jeweiligen Sonden mit potentiellen HDAC6-Bindingspartnern zu ermitteln, die an vielfältigen biologischen Prozessen beteiligt sind, wie Transkriptionsfaktoren, Proteine des Cytoskeletts oder Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems. Abschließend konnte mittels eines MALDI-MS-basierten, kinetischen Assays und Acetyllysin-Substraten gezeigt werden, dass der jeweilige Peptidsequenzkontext einen fein abgestuften Einfluss auf die Geschwindigkeit der durch HDAC6 katalysierten Deacetylierungsreaktion ausübt.