The influence of two phosphotransferases involved in caprazamycin biosynthesis and resistance & Mycothiol peroxidase activity as a part of the self- resistance mechanisms against the antitumoral cosmomycin D

Abstract

Chapter I: Streptomyces sp. MK730-62F2 produziert auf natürliche Weise die antimykobakteriellen Verbindungen Caprazamycine, starke MraY-Translokase-Inhibitoren, die die Peptidoglycan- Biosynthese stören. Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien von Caprazamycinen und Derivaten davon lieferten tiefe Einblicke in Struktureinheiten, die für eine effiziente MraY- Hemmung erforderlich sind. Obwohl die Biosynthese von Caprazamycinen und verwandten Liponucleosid-Antibiotika zum Teil detailliert untersucht wurden, ist nur wenig über plausible Resistenzmechanismen für diese Klasse von Antibiotika bekannt. Das Caprazamycin- Biosynthese-Gencluster kodiert für zwei Phosphotransferasen, Cpz12 und Cpz27, mit hohen Sequenzähnlichkeiten zu der großen Familie von Tunicamycin-Resistenzproteinen. In dieser Studie untersuchten wir die Funktion beider Phosphotransferasen sowie der clusterkodierten ATP-abhängigen Efflux-Pumpe Cpz22. Die Deletion von cpz12 führte zur Akkumulation von (+)-Caprazol, dem die ß-Hydroxy-Fettsäure-Seitenkette fehlte. Derselbe Chemotyp wurde durch Deletion von cpz23 beobachtet, das für eine Lipase kodiert, die für den Transfer der Fettsäure verantwortlich ist. Die Cpz23-Deletionsmutante zeigte dieses Mal aber zusätzlich die Bildung von phosphoryliertem (+)-Caprazol. Da die Deletion von cpz27 dazu führte, dass keine Exkonjuganten erhalten werden konnten, könnte diese Phosphotransferase die wichtigste Resistenzdeterminante gegen Caprazamycine darstellen. Die biochemische Analyse von Cpz27 zeigte eine Beteiligung während der frühen Biosyntheseschritte von Caprazamycinen, die wahrscheinlich ein biologisch aktives Zwischenprodukt inaktiviert. Mutanten, die cpz12, cpz22 oder cpz27 überexprimieren, wurden auf ihre Fähigkeit hin analysiert, die Resistenz gegen Caprazamycine zu stärken, indem ihre minimale Hemmkonzentration (MIC) bestimmt wurde. Unsere Ergebnisse deuten auf einen komplexeren Resistenzmechanismus für Caprazamycine hin, bei dem beide Phosphotransferasen in die Biosynthese von Caprazamycinen eingreifen.

Chapter II: Streptomyces produzieren verschiedene bioaktive Naturstoffe und besitzen Resistenzsysteme für diese Metaboliten, die zusammen mit Antibiotika-Biosynthesegenen reguliert werden. Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produziert das antitumorale Cosmomycin D (COSD), ein Molekül der Anthracyclin-Familie. Das COSD-Biosynthese Gencluster wurde bereits untersucht und die Selbstresistenzmechanismen teilweise charakterisiert, die Funktion der vom Gencluster codierten Micothiolperoxidase MPx ist jedoch bis heute nicht vollständig verstanden. Wir konnten zum ersten Mal zeigen, dass MPx auch ein gemischtes Cystein-MSH-Disulfid mithilfe eines Dithioldisulfid-Austauschmechanismus während der Biosynthese von COSD reduzieren kann. Die durchgeführten Untersuchungen Untersuchungen zu MPx zeigen, dass ROS-entgiftende Gene von Anthrazyklin-Produzenten aufgenommen werden. In dieser Studie beschreiben wir drei Selbstresistenzmechanismen von Streptomyces olindensis gegen COSD. Die Gene cosI und cosJ kodieren für den den ersten Resistenzmechanismus, , ein ABC-Transporter-Efflux-System. Der zweite Mechanismus wird vom cosU-Gen kodiert und ist ähnlich wie drrC von Streptomyces peucetius an der Entgiftung von H2O2 beteiligt. In diesem Projekt wollten wir die folgenden Fragen klären: Warum besitzt das Cosmomycin-ähnlichen gencluster ein Gen, das für eine Micothiolperoxidase codiert? Wie wirkt sich die Toxizität von COSD im Vergleich zu anderen bekannten Anthracyclinen wie DOX aus? Stellt die Micothiolperoxidase MPx bei COSD-ähnlichen Genclustern den Hauptresistenz- Mechanismus dar? untranslated