Programmierter Zelltod humaner Erythrozyten durch Licochalcone A, Manumycin A und Perifosine

Abstract

Hintergrund/Ziele: Licochalcone A ist ein antientzündliches, immunmodulatorisches und antimikrobielles Extrakt der Glycyrrhiza inflata und verursacht Apoptose von Tumorzellen, weswegen es für die Behandlung von Tumoren in Erwägung gezogen wird. Manumycin A ist ein von Streptomyceten hergestellter Farnesyltransferase-Inhibitor, der ebenfalls Apoptose von Tumorzellen verursacht und für die Tumorbehandlung infrage kommt. Perifosine ist ein Alkylphospholipid, welches für die Behandlung von Tumoren verwendet wird. Es wirkt, indem es Apoptose verursacht. Eine der Nebenwirkungen ist Anämie, welche zumindest theoretisch durch die Verursachung von Eryptose begründet sein könnte. Ähnlich der Apoptose von kernhaltigen Zellen können Erythrozyten durch Eryptose zugrunde gehen, die gekennzeichnet ist durch Zellschrumpfung und Zellmembran- Scrambling, was in Zusammenbruch der Zellmembranasymmetrie und Präsentation von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche mündet. Zu den Signalwegen, welche in die Verursachung von Eryptose involviert sind, gehören der Calciumeinstrom und die damit einhergehende Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, Ceramidanreicherung in der Erythrozytenmembran, oxidativer Stress, Proteinkinase C und p38-Kinase.

Fragestellung: Verursachen die Apoptose auslösenden Medikamente Licochalcone A, Manumycin A und Perifosine auch Eryptose, den programmierten Zelltod von Erythrozyten? Wenn ja, über welchen Mechanismus geschieht dies?

Methoden: Humane Erythrozyten von gesunden Probanden wurden bei 37 °C 24 Stunden lang mit Licochalcone A in Konzentrationen von 1–10 μg/ml oder Perifosine in Konzentrationen von 0,25–2,5 μg/ml oder 48 Stunden lang mit Manumycin A in Konzentrationen von 1–10 μg/ml inkubiert. Mit Hilfe des Durchflusszytometers wurden daraufhin die Messungen durchgeführt. Die Phosphatidylserinexposition an der Zelloberfläche wurde anhand der Bindung von Annexin-V, das Zellvolumen mit dem Vorwärtsstreulicht, intrazelluläres Calcium anhand der Fluo3-Fluoreszenz, oxidativer Stress anhand der DCFDA-abhängigen Fluoreszenz und Ceramid mit spezifischen 74 Antikörpern bestimmt. Die Calciumabhängigkeit wurde unter Verwendung von calciumfreier Ringerlösung und die Beteiligung von Kinasen mittels Kinase-Inhibitoren beurteilt. Die Hämolyse wurde mittels photometrischer Messung der Hämoglobinkonzentration im Überstand abgeschätzt.

Ergebnisse: Licochalcone A erhöhte den Prozentsatz der Annexin-V-bindenden Zellen signifikant (≥ 5 μg/ml), verringerte das Vorwärtsstreulicht signifikant (2,5–5 μg/ml), erhöhte die Fluo3-Fluoreszenz signifikant (≥ 7,5 μg/ml) und erhöhte Ceramid signifikant (10 μg/ml). Durch eine calciumfreie extrazelluläre Lösung wurde die Annexin-V- Bindung nicht signifikant beeinflusst, jedoch die Hämolyse signifikant erhöht. Manumycin A in einer Konzentration von ≥ 5 μg/ml erhöhte den Prozentsatz der Annexin-V-bindenden Zellen signifikant, verringerte das Vorwärtsstreulicht signifikant und erhöhte die Hämolyse signifikant. Der Effekt von Manumycin A (10 μg/ml) auf Erythrozyten wurde durch eine calciumfreie extrazelluläre Lösung, durch Staurosporine (1μM) und SB203580 (2μM) signifikant abgeschwächt. Perifosine in einer Konzentration von 2,5 μg/ml erhöhte den Prozentsatz an Annexin-V- bindenden Zellen und verringerte das Vorwärtsstreulicht signifikant. Perifosine erhöhte den Prozentsatz hämolysierter Erythrozyten signifikant (>0,5 μg/ml), erhöhte die Fluo3- Fluoreszenz signifikant (2,5 μg/ml), verringerte aber die DCFDA-Fluoreszenz und die Ceramid-abhängige Fluoreszenz signifikant (2,5 μg/ml). Der Effekt von Perifosine (2,5μg/ml) auf die Annexin-V-Bindung wurde signifikant gehemmt durch eine calciumfreie extrazelluläre Lösung und durch Hinzugabe von Staurosporine (1μM), nicht jedoch von SB203580 (2μM).

Schlussfolgerungen: Licochalcone A führt zu Zellschrumpfung und Phospholipidscrambling der Erythrozytenmembran. Der Effekt ist unabhängig vom Calciumeinstrom und wahrscheinlich teilweise durch Ceramid hervorgerufen. Manumycin A verursacht Hämolyse, Zellschrumpfung und Phospholipidscrambling der Erythrozytenmembran. Dieser Effekt ist teilweise, aber nicht vollständig abhängig vom Calciumeinstrom und von Staurosporine- und SB203580-sensitiven Kinasen. Perifosine verursacht Eryptose, ein Effekt, welcher zumindest zum Teil von Calciumeinstrom und Aktivierung von Staurosporine-sensitiven Kinasen abhängt.