Dissertation ist gesperrt bis 03.02.2023 !!
Die N-ε-Acetylierung von Lysin-Seitenketten ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen von Proteinen. Lysin-Acetylierungen werden von Histon-Acetyltransferasen (HATs) eingeführt, von Histon-Deacetylasen (HDACs) abgespalten und dienen Bromodomänen (BRDs) als Bindemotiv. Das Zusammenspiel dieser Proteine reguliert eine Vielzahl zellulärer Prozesse, wie zum Beispiel Chromatin-Remodellierung und Transkription. Eine Deregulierung von HDACs und BRDs steht in Verbindung mit der Entwicklung von Krebs und einer Vielzahl weiterer Erkrankungen, was HDACs und BRDs zu vielversprechenden therapeutischen Angriffspunkten macht. Eine Voraussetzung für die Entwicklung hochspezifischer Inhibitoren für diese Proteine ist die Erforschung ihrer Substrate und Bindungsstellen. Eine erste Generation von synthetischen Liganden für HDACs und BRDs wurde bereits entwickelt und könnte die Entwicklung chemischer Sonden für die Erforschung der Substratselektivität dieser Enzyme ermöglichen.
In dieser Arbeit wurden Triazol-basierte Aminosäuren auf der Basis des BRD-Inhibitors JQ1 synthetisiert, welche potentiell als Acetyllysin-Mimikry fungieren könnten. Diese Aminosäuren wurden in von Histon H3 und H4 abgeleitete Peptidsequenzen eingefügt und in Pulldown-Experimenten auf deren Bindung von BRDs hin untersucht. Anhand dieser Versuche konnte Aminoheptansäure-ε-3-methyl-1,2,4-triazol (ApmTri) als wirkungsvollstes Acetyllysin-Mimikry für BRDs der BET-Familie identifiziert werden. Pulldown-Assays und Dissoziationskonstanten (KDs) zeigten auf, dass die BET-BRDs BRD3(2), BRD4(2) und BRD4(1) ApmTri-Peptidsubstrate mit vergleichbarer Affinität wie ihre nativen Acetyllysin-Substrate binden können. Es wurden Kristallstrukturen von BRD3(2) und BRD4(1) mit gebundenen ApmTri-Substraten gelöst, welche zeigten, dass die Triazolstruktur das N-ε-Amid von Acetyllysin erfolgreich imitierte. Im Folgenden wurde die Stabilität der nicht-kanonischen Aminosäure ApmTri gegenüber HDACs beobachtet, was die genetische Kodierung und den Einbau von ApmTri in Proteine in HEK-Zellen ermöglichte. Die Co-Expression von BRD3(2) und Fusionsproteinen mit inkorporiertem ApmTri erlaubte die gemeinsame Präzipitation beider Interaktionspartner aus nativem HEK-Zelllysat.
Die bereits etablierte HDAC-bindende Aminosäure AsuHd wurde ebenfalls genetisch codiert und somit ein neues Werkzeug für die Erforschung von HDACs erhalten. Mithilfe von rekombinanten, AsuHd enthaltenden Proteinen konnten endogene HDACs aus HEK-Zelllysat co-immunopräzipitiert werden. Das Potenzial von AsuHd-basierten Proteinsonden wurde ebenfalls für die Generierung von vollständigen Nukleosomen-Grundpartikeln (NCPs) genutzt, indem mithilfe von Sortase-vermittelter Ligation synthetische AsuHd-H3-Peptide an die NCP-Struktur ligiert wurden. Diese Designer-NCPs waren in der Lage, HDAC-Komplexe mit höherer Spezifität und Effektivität zu rekrutieren als die entsprechenden Peptid-basierten AsuHd-Sonden. Eine massenspektrometrische Analyse des Interaktoms von AsuHd-NCPs zeigte die erfolgreiche Anreicherung von HDAC 1, 2, 6 und weiterer 38 neuer, potentieller HDAC-Interaktionspartner.