Synthesis, biochemical characterization and genetic encoding of acetyl-lysine mimicking amino acids for bromodomains and deacetylases

Abstract

Dissertation ist gesperrt bis 03.02.2023 !!

N-ε-acetylation of lysine residues is one of the most abundant post-translational modifications (PTMs) of proteins in all kingdoms of life. Lysine acetylation is installed by histone acetyltransferases (HATs), removed by histone deacetylases (HDACs) and serves as binding site for bromodomains (BRDs). The orchestrated interplay of these proteins is involved in regulation of various cellular processes including chromatin remodeling and transcription. Dysregulation of HDACs and BRDs can result in the development of diseases such as cancer. This renders HDACs and BRDs as promising therapeutic targets. Insight into the substrates and binding sites of HDACs and BRDs is a prerequisite for understanding the disease mechanisms and the development of highly specific HDAC and BRD inhibitors. A first generation of synthetic inhibitors and small-molecule ligands have already been developed for HDACs and BRDs, which could potentially be re-designed into chemical probes for investigating HDAC and BRD substrate selectivities. In this study, a set of triazole-containing amino acids was synthesized as potential acetyl-lysine mimics for BRDs on the basis of BRD inhibitor JQ1. The amino acids were incorporated into histone H3 and H4 derived peptide probes and tested for BRD binding in pulldown experiments. These experiments revealed aminoheptanedioic acid-ε-3-methyl-1,2,4-triazole (ApmTri) as most potent acetyl-lysine mimic for BRDs of the BET family. Recombinant BET BRD proteins BRD3(2), BRD4(2) and BRD4(1) bound ApmTri-containing peptide substrates with similar affinity as the native acetyl-lysine substrate as observed in pull-down experiments and indicated by KD values. Obtained crystal structures of BRD3(2) and BRD4(1) with bound ApmTri substrates illustrated that the triazole moiety efficiently mimicked the N-ε-amide in acetyl-lysine. ApmTri was further shown to be stable towards HDACs, enabling the subsequent genetic encoding and incorporation of this non-canonical amino acid into proteins of HEK cells. Co-expression of BRD3(2) and ApmTri-containing fusion proteins allowed co-precipitation of both interaction partners from native HEK lysates. In order to generate new tools for HDAC research, the already established HDAC-trapping amino acid AsuHd was genetically encoded as well. Recombinant AsuHd-containing proteins were able to co-immunoprecipitate endogenous HDACs from HEK lysates. The ability of AsuHd-containing protein probes was further extended to whole nucleosome core particles (NCPs). In this case, sortase-mediated ligation was used for linking synthetic AsuHd-containing histone H3 tails to the NCP structure. AsuHd designer NCPs recruited HDAC complexes more specifically and efficient than AsuHd-containing peptide probes. Mass spectrometry-based interactome profiling of AsuHd-NCPs uncovered efficient enrichment of HDACs 1, 2, 6 and 38 new potential HDAC binding proteins.

Die N-ε-Acetylierung von Lysin-Seitenketten ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen von Proteinen. Lysin-Acetylierungen werden von Histon-Acetyltransferasen (HATs) eingeführt, von Histon-Deacetylasen (HDACs) abgespalten und dienen Bromodomänen (BRDs) als Bindemotiv. Das Zusammenspiel dieser Proteine reguliert eine Vielzahl zellulärer Prozesse, wie zum Beispiel Chromatin-Remodellierung und Transkription. Eine Deregulierung von HDACs und BRDs steht in Verbindung mit der Entwicklung von Krebs und einer Vielzahl weiterer Erkrankungen, was HDACs und BRDs zu vielversprechenden therapeutischen Angriffspunkten macht. Eine Voraussetzung für die Entwicklung hochspezifischer Inhibitoren für diese Proteine ist die Erforschung ihrer Substrate und Bindungsstellen. Eine erste Generation von synthetischen Liganden für HDACs und BRDs wurde bereits entwickelt und könnte die Entwicklung chemischer Sonden für die Erforschung der Substratselektivität dieser Enzyme ermöglichen. In dieser Arbeit wurden Triazol-basierte Aminosäuren auf der Basis des BRD-Inhibitors JQ1 synthetisiert, welche potentiell als Acetyllysin-Mimikry fungieren könnten. Diese Aminosäuren wurden in von Histon H3 und H4 abgeleitete Peptidsequenzen eingefügt und in Pulldown-Experimenten auf deren Bindung von BRDs hin untersucht. Anhand dieser Versuche konnte Aminoheptansäure-ε-3-methyl-1,2,4-triazol (ApmTri) als wirkungsvollstes Acetyllysin-Mimikry für BRDs der BET-Familie identifiziert werden. Pulldown-Assays und Dissoziationskonstanten (KDs) zeigten auf, dass die BET-BRDs BRD3(2), BRD4(2) und BRD4(1) ApmTri-Peptidsubstrate mit vergleichbarer Affinität wie ihre nativen Acetyllysin-Substrate binden können. Es wurden Kristallstrukturen von BRD3(2) und BRD4(1) mit gebundenen ApmTri-Substraten gelöst, welche zeigten, dass die Triazolstruktur das N-ε-Amid von Acetyllysin erfolgreich imitierte. Im Folgenden wurde die Stabilität der nicht-kanonischen Aminosäure ApmTri gegenüber HDACs beobachtet, was die genetische Kodierung und den Einbau von ApmTri in Proteine in HEK-Zellen ermöglichte. Die Co-Expression von BRD3(2) und Fusionsproteinen mit inkorporiertem ApmTri erlaubte die gemeinsame Präzipitation beider Interaktionspartner aus nativem HEK-Zelllysat. Die bereits etablierte HDAC-bindende Aminosäure AsuHd wurde ebenfalls genetisch codiert und somit ein neues Werkzeug für die Erforschung von HDACs erhalten. Mithilfe von rekombinanten, AsuHd enthaltenden Proteinen konnten endogene HDACs aus HEK-Zelllysat co-immunopräzipitiert werden. Das Potenzial von AsuHd-basierten Proteinsonden wurde ebenfalls für die Generierung von vollständigen Nukleosomen-Grundpartikeln (NCPs) genutzt, indem mithilfe von Sortase-vermittelter Ligation synthetische AsuHd-H3-Peptide an die NCP-Struktur ligiert wurden. Diese Designer-NCPs waren in der Lage, HDAC-Komplexe mit höherer Spezifität und Effektivität zu rekrutieren als die entsprechenden Peptid-basierten AsuHd-Sonden. Eine massenspektrometrische Analyse des Interaktoms von AsuHd-NCPs zeigte die erfolgreiche Anreicherung von HDAC 1, 2, 6 und weiterer 38 neuer, potentieller HDAC-Interaktionspartner.