Bioreporters for mode of action-informed antibiotic screening and their transcriptional regulation in Bacillus subtilis.

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URI: http://hdl.handle.net/10900/125223
http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-dspace-1252237
Dokumentart: Dissertation
Date: 2023-12-21
Language: English
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Biologie
Advisor: Brötz-Oesterhelt, Heike (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2021-12-21
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

 
Dissertation ist gesperrt bis zum 21.12.2023 !!
 
Der Großteil der heutzutage angewandten Antibiotika gehört zur Gruppe der Naturstoffe oder wurde durch Modifizierung einzelner funktioneller Gruppen von ihnen abgeleitet. Auf der Suche nach neuen Antibiotika konzentrieren sich viele aktuelle Forschungsprojekte erneut auf Naturstoffproduzenten, da Naturstoffe komplexe physiochemische Eigenschaften bezüglich einer guten bakteriellen Aufnahme, intrazellulären Verfügbarkeit und Bindung an die Zielstruktur in sich vereinen und durch rationales Design nur sehr schwer nachzuahmen sind. Es besteht die gerechtfertigte Hoffnung, dass die Untersuchung neuer Produzentenstämme aus weniger erforschten Nischen potenziell neue antimikrobiell wirksame Substanzen hervorbringt. Außerdem konnte durch Genomsequenzierung festgestellt werden, dass viele Produzentenstämme das Potential besitzen zusätzliche Sekundärmetabolite zu synthetisieren, welche in sogenannten kryptischen oder stillen Genclustern codiert sind. Die Aktivierung dieser Gencluster, z.B. durch die Anzucht der Produzentenstämme unter neuen Wachstums- oder Stressbedingungen, die genetische Manipulation der Genregulation oder die heterologe Genexpression, ist ebenso Bestandteil aktueller Forschung. Um diese Auswahl an potenziellen Naturstoffproduzenten effektiv zu beproben, benötigt man, neben verbesserten Aufreinigungs- und Dereplikationsmethoden, vor allem schnelle, robuste und selektive Screeningmethoden, welche einen hohen Informationsgehalt generieren. In dieser Arbeit wurde ein Agar-basierter Bioreporteransatz entwickelt und validiert, der ein kombiniertes Bioaktivitäts- und Wirkmechanismus (MOA)-informiertes Screening ermöglicht. Die verwendeten ß-Galaktosidase-basierten Bacillus subtilis Bioreporter-konstrukte zeigten eine selektive Induktion bei antimikrobieller Interferenz mit einem der Hauptstoffwechselwege: DNA-Synthese (PyorB-lacZ), RNA-Synthese (Prpt-lacZ und PhelD-lacZ), Proteinbiosynthese (PbmrC-lacZ, selektiv für Translationsarrest) und Integrität der Zellhülle (PypuA-lacZ und PliaI-lacZ). Die Induktionsspezifität der Bioreporterstämme im Agar-basierten Testverfahren wurde unter Verwendung von ~90 Referenzantibiotika mit bekanntem MOA bestätigt. Da Prpt als Bioreporter bisher unbeschrieben war, musste seine Induktionsspezifität und -sensitivität in Bezug auf RNA-Stress sowohl im Agar-basierten Ansatz sowie in einem flüssigen, Luciferase-basierten System eingehend profiliert werden. Nach der Validierung der Bioreporterstämme, ermöglichte der Agar-basierte Test die Charakterisierung unbekannter, antimikrobieller Wirkstoffe, wie z.B. die Untersuchung von Microcionamid A und C. Generell wies die Bioreporter-basierte MOA-Profilierung den Hauptstoffwechselweg auf, welcher durch die antibiotische Aktivität spezifisch gehemmt wurde, und ermöglichte die Auswahl geeigneter Folgestudien zur Aufklärung der molekularen Zielstruktur. Weiterhin wurde der Agar-basierte Bioreporteransatz auf seine Anwendbarkeit im direkten Screening von Antibiotika-Produzentenstämmen untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass produzierte antimikrobielle Wirkstoffe durch die direkte Untersuchung von Agarproben oder Kulturüberständen der kultivierten Produzentenstämme sensitiv detektiert und bezüglich ihres MOA profiliert werden können, ohne dass eine initiale Wirkstoffaufreinigung erforderlich war. Dies war besonders interessant, da Antibiotika-Produzentenstämme oft das genetische Potenzial besitzen, verschiedene antimikrobielle Sekundärmetabolite zu synthetisieren, welche mit Hilfe der zusätzlichen MOA-Information der Bioreporterstämme schnell unterschieden werden können. Das Testverfahren bietet zudem den Vorteil, den gesamten Aufreinigungsprozess eines Wirkstoffes zu überwachen, da unbearbeitete Produzentenstämme, Extrakte, fraktionierte Proben oder Reinsubstanzen auf das Vorhandensein der zuvor detektierten Aktivität inklusive Bioreportersignal getestet werden können. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der Agar-basierte Bioreporteransatz in der Lage ist, Polypharmakologie oder synergistische Effekte von antimikrobiellen Substanzen sensitiv nachzuweisen. Die selektive Hochregulierung der ausgewählten B. subtilis Bioreportergene durch antibiotische Interferenz mit einem der oben genannten Hauptstoffwechselwege war in einer früheren Transkriptom-Studie entdeckt worden. Die Funktion und Regulation der identifizierten B. subtilis-Gene sind jedoch nur teilweise charakterisiert. Ein besseres Verständnis der initiierten Stressantworten, welche die selektive Induktion der Gene regulieren, ermöglicht eine verfeinerte MOA-Charakterisierung der induzierenden Antibiotika und erlaubt potenziell neue Einblicke in zelluläre Anpassungs- oder Resistenzmechanismen. Daher wurde in dieser Arbeit die Regulation der Bioreportergene rpt, helD und yorB untersucht, welche nach Behandlung mit RNA-, respektive DNA-Synthese-hemmenden Antibiotika selektiv hochreguliert werden. Bezüglich der Genregulation von rpt und helD ließen die Induktionsprofile von Prpt und PhelD nach Antibiotikabehandlung, welche zusätzlich in einem quantitativen, Luciferase-basierten Reportersystem gemessen wurden, auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus schließen. Weitere Ergebnisse wie Promotor-Deletionsstudien und DNA-Affinitäts-Capturing-Assays, deuteten darauf hin, dass die SigA-regulierten Gene rpt und helD zu einer cis-kodierten Antisense-RNA-regulierten Stressantwort gehören, welche möglichweise selektiv durch das zelluläre Erkennen blockierter RNA-Polymerase-Komplexe induziert wird. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass das SPß-Prophagenprotein YorB LexA-reguliert und somit Teil der SOS-Antwort in B. subtilis ist. Schließlich wurde die bisher nicht charakterisierte Funktion von Rpt (früher PpS/YppS) aus B. subtilis aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass Rpt eine selektive Resistenz gegen Rifamycine verleiht, indem es diese spezifisch phosphoryliert und damit inaktiviert.
 

Abstract:

Most of todays applied antibiotics belong to the group of natural products or have been derived from them, by modifying individual functional groups. In the search for new antibiotics, current research is again concentrating on natural product discovery, since those compounds combine complex physiochemical properties with regard to good bacterial uptake, intracellular retainment, and target engagement, which cannot simply be mimicked by rational design. There is justified hope that the investigation of new producer strains from less explored niches could reveal new natural products. Genome sequencing has also shown that many producer strains possess the potential to synthesize additional secondary metabolites, which are encoded in so-called cryptic or silent gene clusters. The activation of those gene clusters, e.g., by cultivation of the producer strains under different growth or stress conditions, genetic manipulation of gene regulation, or heterologous expression, is also part of current research. In order to effectively screen all those potential natural product producers, improved purification and dereplication methods are required and, above all, fast, robust, and selective screening procedures, which generate high content information. In this thesis, an agar-based bioreporter approach was developed and validated, which allows for combined bioactivity and mode of action-informed screening. The employed ß-galactosidase-based Bacillus subtilis bioreporter constructs showed selective induction upon antimicrobial interference with one of the main metabolic pathways: DNA synthesis (PyorB-lacZ), RNA synthesis (Prpt-lacZ and PhelD-lacZ), protein biosynthesis (PbmrC-lacZ, selective for translation arrest) and integrity of the cell envelope (PypuA-lacZ and PliaI-lacZ). Induction specificity of the bioreporter panel in the agar-based setup was confirmed using a large set of ~90 reference antibiotics with known MOA. Of note, Prpt had not previously been described as bioreporter and was therefore extensively profiled for its induction specificity and sensitivity upon RNA stress in the agar-based assay as well as in a liquid, luciferase-based system. After validation of the bioreporter panel, the agar-based approach allowed the characterization of unknown antimicrobial agents, like the investigated compounds microcionamide A and C. Generally, the bioreporter-based MOA profiling indicated the metabolic pathway(s) of antibiotic interference and allowed for the selection of adequate MOA follow-up studies to elucidate the exact molecular target. Furthermore, the agar-based bioreporter approach was evaluated for its applicability in direct screening of antibiotic producer strains. It could be proven that produced antimicrobials can be sensitively detected and MOA-profiled by direct probing of agar plugs or culture supernatants of the cultivated producer strains, with no need for initial compound purification. This finding was especially interesting as antibiotic producer strains often possess the genetic potential to synthesize different antimicrobial secondary metabolites, which can rapidly be distinguished using the additional MOA information of the bioreporter panel. The assay also bears the advantage to monitor the entire purification process of a bioactive substance, allowing to test unprocessed producer strains, extracts, fractionated samples, or pure substances for the presence of the previously detected activity and bioreporter signal of interest. It could further be shown, that the agar-based bioreporter approach is able to sensitively detect polypharmacology or synergistic effects of antimicrobial substances. The specific upregulation of the selected B. subtilis bioreporter genes upon antibiotic interference with one of the upper mentioned main metabolic pathways was discovered in a previous transcriptome study. However, the function and regulation of the identified B. subtilis genes are only partially characterized. A better understanding of the initiated stress responses that regulate selective gene induction would enable a refined MOA characterization of the inducing antibiotics, and potentially allow new insights into cellular adaptation or resistance mechanisms. Hence, regulation of the bioreporter genes rpt, helD, and yorB, which are selectively upregulated upon exposure to antibiotics that inhibit RNA or DNA synthesis, respectively, was investigated in this work. For gene regulation of rpt and helD, the induction profiles of Prpt and PhelD upon antibiotic treatment in a quantitative, luciferase-based reporter system, already pointed at a similar regulation mechanism. Further results like promoter deletion studies or DNA affinity capturing assays indicated, that the SigA-regulated genes rpt and helD both belong to a cis-encoded antisense RNA-regulated stress response, which is proposed to be selectively induced by the cellular sensing of stalled RNA polymerase complexes. The SPß-prophage protein YorB was proven to be LexA-regulated and thus part of the SOS response in B. subtilis. Finally, the function of B. subtilis Rpt (formerly PpS/YppS), which had not been previously characterized, was elucidated. It could be shown that Rpt confers selective resistance to rifamycins by phosphorylation inactivation.

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